Summary
Nous décrivons un processus pour la fixation, l'incorporation, de sectionnement et de l'imagerie du stade tardif
Abstract
La morphogenèse de la
Protocol
- Fraîchement préparer 2ml d'une solution de fixateur contenant du glutaraldéhyde 12,5% dans un tampon cacodylate 50mM (pH 7,4) dans un flacon en verre de 20 ml à scintillation. Ajouter 8 ml de n-heptane et agiter vigoureusement. Laisser les deux phases se séparer. Retirer phase supérieure contenant le n-heptane saturés avec du glutaraldéhyde, le placer dans un flacon à scintillation propre et mis de côté. Ce sera la solution de fixation.
- Recueillir des embryons de 00 à 20 heures en utilisant une chambre de collecte d'embryons, qui est un petit panier avec un tamis amovible. Retirer la membrane externe du chorion par trempage des embryons dans une solution javellisée à 50% pendant 2-3 minutes, ou jusqu'à ce que les embryons flottent à la surface de l'eau de Javel. Rincez abondamment avec des embryons ddH20 et éponger sur un papier absorbant.
- En utilisant des pinces, ramasser tamis qui est recouvert d'embryons dechorionated et lieu dans la solution de fixation, permettant embryons à tomber à partir du maillage. Autoriser les embryons de fixer pendant 1,5 heures à 4 ° C tout en mélangeant sur un Nutator.
- Préparez une boîte de Pétri bordée de ruban adhésif double face. Retirer le fixateur d'embryons en utilisant une pipette Pasteur et les placer sur la surface enregistrée de Petri dish.Transfer les embryons dans une quantité minime de solution de fixation pour empêcher l'heptane dans le fixateur de se dissoudre la colle de la bande. Secouez la boîte de Pétri pour faire une seule couche d'embryons. Placez une boîte de Pétri dans le capot jusqu'à évaporation d'heptane. Ajouter suffisamment Tween 20 PBS + 0,1% pour couvrir les embryons. Hand-devitellinize stade tardif 16 embryons sous un microscope à dissection avec une aiguille de tungstène émoussé. Récupérer des embryons avec une pipette Pasteur dans un tube de 1,5 ml. Étapes 5-7 sont menées dans ce tube de centrifugeuse.
- Rincez embryons dans 0,1 M de cacodylate pH 7,4 puis post-fixer dans une solution contenant du tétroxyde d'osmium à 1% dans 0,1 M tampon cacodylate à pH 7,4 pendant 1 heure à température ambiante. Rincez embryons avec 0,1 M de cacodylate pH 7,4.
- Déshydrater embryons dans une série graduée de l'éthanol et l'acétone. Déshydrater embryons avec de l'éthanol 50% pendant 10 minutes, suivie par 70% d'éthanol pendant 10 minutes. Puis se déshydrater dans l'acétone à 90% pendant 10 minutes, et deux étapes 100% d'acétone de 10 minutes chacune.
- Enlever l'acétone et ensuite commencer le processus d'infiltration en y ajoutant une 01:01 Epon-Spurr résine: le mélange d'acétone pour les embryons. Micro-ondes pendant trois minutes en utilisant un micro-ondes Pelco Biowave Pro tout en gardant l'échantillon sous pression à vide. Appliquer une pression à vide pour l'échantillon pour une période supplémentaire de cinq minutes après que le micro-ondes est terminée. Bourse de la résine 1:1, mélange acétone à 100% Epon-Spurr résine et micro-ondes à nouveau sous pression à vide. Bourse de 100% de résine Epon-Spurr une dernière fois, et micro-ondes sous pression à vide.
- En utilisant une pipette Pasteur, les embryons sont transférés du tube de centrifugeuse pour un moule en silicone intégrant. Aligner les embryons dans une rangée de telle sorte que l'extrémité postérieure de l'embryon s'aligne avec le bord du moule conique. Cuire au four à 70 ° C pendant la nuit.
- Retirer l'échantillon et se préparer pour la coupe.
- Commencez à couper des sections 1 um en utilisant un couteau de diamant Histo et Richert Ultracut E microtome. Prenez note de quand la section premier embryon est atteint. De ce point, coupé 100 microns dans l'échantillon. Supprimer une section en utilisant une boucle, et placer sur une lame de verre. Brièvement la chaleur de la section sur une plaque chauffante. Tache de la section en utilisant une goutte de bleu de méthylène. Sous un microscope optique d'identifier la lumière du cœur.
- Coupez les sections 90nm utilisant un ultra Diamant 45 ° Couteau et Richert Ultracut E microtome. Ramassez plusieurs sections sur une grille de cuivre.
- Les grilles sont colorées à l'acétate d'uranyle 3% saturés dans l'éthanol à 50% pendant dix minutes, puis rincés trois fois à l'eau bidistillée. Ensuite, les grilles sont colorées avec du citrate de plomb (dissous dans 10ml 0.04gms eau bidistillée et 100ml de NaOH 10M) pendant 2,5 minutes dans une chambre contenant des pastilles de NaOH pour créer un sans CO 2 environnement. Les grilles sont rincés trois fois à l'eau bidistillée.
- Les articles sont examinés avec un microscope électronique JEOL 1200EX à 80Kv, et photographiés avec un appareil photo numérique de l'AMT.
Discussion
La morphogenèse du tube drosophile coeur embryonnaire a émergé comme un système modèle précieux pour étudier l'adhésion cellulaire et les changements de forme cellulaire durant le développement embryonnaire. Une des difficultés rencontrées dans l'étude de cette structure est que la lumière du tube cardiaque est difficile à visualiser dans des embryons de monter ensemble. La technique illustrée dans cette vidéo, qui a été adapté à partir des procédures décrites précédemment 1-2, s'est révélée être réussi à façon efficace et fiable l'analyse d'un nombre considérable de génotypes pour tube cardiaque et la formation de lumière 3.
Acknowledgments
Notre travail sur la formation du tube cardiaque a été soutenu par une subvention National Science Foundation (0744165 ID Award) pour SGK
References
- Tepass, U., Hartenstein, V. The Development of Cellular Junctions in the Drosophila embryo. Dev. Biol. 161, 563-596 (1994).
- Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, S. Drosophila Protocols. , (2000).
- Santiago-Martinez, E., Soplop, N. H., Patel, R., Kramer, S. G. Repulsion by Slit and Roundabout prevents Shotgun/E-cadherin-mediated cell adhesion during Drosophila heart tube lumen formation. J. Cell Biol. 182, 241-248 (2008).
