Beredning av embryon för elektronmikroskopi av Drosophila Embryonala hjärta tub

Summary

Vi beskriver en process för fixering, inbäddning, snittning, och avbildning av sen

Abstract

Den morfogenes av

Protocol

1. Färskt förbereda 2ml av en fixativ lösning innehållande 12,5% glutaraldehyd i 50 mM Cacodylate buffert (pH7.4) i en 20 ml glasflaska scintillation flaskan. Lägg 8ml av n-heptan och skaka kraftigt. Låt två faserna separera. Ta bort övre fasen som innehåller n-heptan mättad med glutaraldehyd, placera i en ren scintillation flaskan och ställ åt sidan. Detta kommer att vara Fixeringslösning.
2. Samla 0-20 timme embryon med hjälp av en kammare embryosamlingen, som är en liten korg med en avtagbar mesh insats. Ta bort den yttre chorion membranet genom att blötlägga embryon i en 50% blekmedel lösning i 2-3 minuter, eller tills embryon flyter upp till ytan av blekmedel. Skölj noga med ddH20 och blot embryon på en pappershandduk.
3. Använd pincett, plocka upp avgassilen som är täckt med dechorionated embryon och placera i Fixeringslösning, vilket gör att embryon faller av mesh. Låt embryon att fastställa till 1,5 timmar vid 4 ° C medan blandning på en Nutator.
4. Förbered en petriskål fodrad med dubbelhäftande tejp. Ta bort embryon från fixativ med en Pasteur-pipett och placera dem på tejpade ytan av Petri dish.Transfer embryona i en minimal mängd fixativ lösning för att förhindra att heptan i fixativ från att lösa upp limmet på bandet. Skaka petriskål att göra ett enda lager av embryon. Placera petriskål i huvan tills heptan avdunstar. Lägg tillräckligt PBS + 0,1% Tween20 att täcka embryon. Hand-devitellinize sent stadium 16 embryon under ett dissekera mikroskop med en trubbig volfram nål. Återställ embryon med en Pasteurpipett i en 1,5 ml mikrofugrör. Steg 5-7 utförs i denna mikrofugrör.
5. Skölj embryon i 0,1 miljoner Cacodylate buffert, pH 7,4 och sedan efter fix i en lösning som innehåller 1% osmium Tetroxide i 0,1 miljoner Cacodylate buffert, pH 7,4 i 1 timme i rumstemperatur. Skölj embryon med 0,1 miljoner Cacodylate buffert, pH 7,4.
6. Torka embryona i en graderad serie av etanol och aceton. Torka embryon med 50% etanol i 10 minuter, följt av 70% etanol i 10 minuter. Sedan torka i 90% aceton i 10 minuter, och två 100% steg aceton på 10 minuter vardera.
7. Ta aceton och sedan börja infiltration processen genom att lägga till en 1:1 Epon-Spurr harts: acetonblandning till embryon. Mikrovågsugn i tre minuter med hjälp av en Pelco Biowave Pro micro och samtidigt hålla provet under vakuum tryck. Applicera vakuum tryck provet för ytterligare fem minuter efter att mikrovågsugnen är avslutad. Byt 01:01 harts, aceton blandning med 100% Epon-Spurr harts och mikrovågsugn igen under vakuum tryck. Byt ut 100% Epon-Spurr harts en sista gång, och mikrovågsugn under vakuum tryck.
8. Med hjälp av en Pasteur-pipett, är embryon överförs från mikrofugrör till en silikon bädda mögel. Passa embryon i en rad så att den bakre änden av embryot linje med den koniska kanten av formen. Grädda i en 70 ° C ugn över natten.
9. Ta ut provet och förbereda sig för sektionering.
10. Börjar såga 1μm sektioner med hjälp av en Diamond Histo Kniv och Richert Ultracut E mikrotomen. Ta del av när den första embryot delen nås. Från denna punkt, skär 100μm i provet. Ta bort ett avsnitt med hjälp av en loop, och placera på en glasskiva. Kortfattat värme avsnittet på en värmeplatta. Fläck avsnittet med en droppe av metylenblått. Enligt ett ljusmikroskop identifiera hjärtat lumen.
11. Skär 90nm sektioner med hjälp av en Diamond Ultra 45 ° Kniv och Richert Ultracut E mikrotomen. Plocka upp flera avsnitt på en koppar rutnät.
12. Galler färgas med 3% AUC acetat mättad i 50% etanol i tio minuter och sedan sköljas tre gånger i dubbeldestillerat vatten. Sedan är näten färgas med bly citrat (0.04gms löst i 10ml dubbla destillerat vatten och 100 ml 10M NaOH) för 2,5 minuter i en kammare som innehåller NaOH pellets för att skapa en CO _2-miljö. Näten sköljs tre gånger i dubbeldestillerat vatten.
13. Sektioner undersöks med en JEOL 1200EX elektronmikroskop på 80Kv, och fotograferade med en AMT digitalkamera.

Discussion

Den morfogenes av Drosophila embryonala hjärtat röret har vuxit fram som en värdefull modell för att studera cellers vidhäftning och celler ändrar form under fosterutvecklingen. En av utmaningarna i att studera denna struktur är att lumen i hjärtats röret är svårt att visualisera i hela berget embryon. Tekniken visade i denna video, som var anpassad från tidigare beskrivna förfarandena ^1-2, har visat sig vara framgångsrik i ett effektivt och tillförlitligt analysera ett stort antal genotyper för hjärt-rör och lumen bildandet ^3.