Preparación de embriones para Microscopía Electrónica de la Drosophila Tubo cardíaco embrionario

Summary

Se describe un proceso para la fijación, inclusión, corte, y las imágenes de la etapa terminal

Abstract

La morfogénesis de la

Protocol

1. Recién preparar 2 ml de una solución fijadora contiene 12,5% de glutaraldehído en tampón cacodilato 50 mM (pH 7,4) en un vial de centelleo de 20 ml de vidrio. Añadir 8 ml de n-heptano y agitar vigorosamente. Permitir a las dos fases se separen. Retire la fase superior que contiene n-heptano saturado con glutaraldehído, el lugar en un vial de centelleo limpio y dejar de lado. Esta será la solución fijadora.
2. Recoger embriones 00-20 horas usando una cámara de recogida de embriones, que es una pequeña cesta con una inserción de malla extraíble. Quitar la membrana externa del corion por inmersión de embriones en una solución de lejía al 50% durante 2-3 minutos, o hasta que los embriones flotan en la superficie de la lejía. Enjuague bien con embriones ddH20 y mancha en una toalla de papel.
3. Con unas pinzas, recoja el tamiz que se cubre con embriones dechorionated y lugar en la solución de fijación, lo que permite embriones a caer de la malla. Permita que los embriones para fijar durante 1,5 horas a 4 ° C mientras se mezcla en un Nutator.
4. Prepare una placa de Petri llena de cinta de doble cara. Eliminar embriones del fijador con una pipeta Pasteur y colocarlos sobre una superficie grabada de Petri dish.Transfer los embriones en una cantidad mínima de solución fijadora para evitar que el heptano en el fijador de disolver el pegamento de la cinta. Agitar la placa de Petri para hacer una sola capa de embriones. Coloque una placa de Petri en la campana hasta que se evapore heptano. Añade suficiente Tween20 PBS + 0,1% para cubrir los embriones. Devitellinize mano etapa tardía de 16 embriones en un microscopio con una aguja de tungsteno contundente. Recuperar los embriones con una pipeta Pasteur a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Los pasos 5-7 se llevan a cabo en este tubo de microcentrífuga.
5. Enjuague los embriones en 0,1 M cacodilato, pH 7,4 y después de fijar en una solución que contiene 1% de tetróxido de osmio en 0,1 M cacodilato tampón, pH 7,4 durante 1 hora a temperatura ambiente. Enjuague los embriones con 0,1 M cacodilato, pH 7,4.
6. Deshidratar los embriones en una serie gradual de etanol y acetona. Deshidratar embriones con un 50% de etanol durante 10 minutos, seguido por el 70% de etanol durante 10 minutos. Luego se deshidratan en un 90% de acetona durante 10 minutos, y dos pasos de 100% de acetona de 10 minutos cada uno.
7. Eliminar la acetona y luego comenzar el proceso de infiltración mediante la adición de una relación 1:1 Epon-resina Spurr: mezcla de acetona a los embriones. Microondas durante tres minutos con un Pelco Biowave microondas Pro, manteniendo la muestra bajo la presión de vacío. Aplicar presión de vacío para la muestra por otros cinco minutos después de la microonda ha terminado. Intercambio de las 1:01 de resina, la mezcla de acetona con Epon-Spurr resina 100% y de microondas de nuevo bajo la presión de vacío. Cambio del 100% Epon-resina Spurr por última vez, y microondas bajo la presión de vacío.
8. Con una pipeta Pasteur, los embriones se transfieren desde el tubo de microcentrífuga a un molde de silicona incrustación. Alinear los embriones en una fila de tal manera que el extremo posterior del embrión se alinea con el borde afilado del molde. Hornear en un horno de 70 º C durante la noche.
9. Quitar la muestra y prepararse para el corte.
10. Comenzar a recortar las secciones con un diamante de 1μm Histo cuchillo y Richert Ultracut E microtomo. Tome nota de que la sección de primer embrión es alcanzado. Desde este punto, corte 100μm en la muestra. Remover una sección con un bucle, y el lugar en un portaobjetos de vidrio. En pocas palabras el calor de la sección en un plato caliente. Tinción de la sección con una gota de azul de metileno. Bajo un microscopio de luz identificar la luz del corazón.
11. Los cortes de secciones de 90nm con un ultra Diamante 45 ° Cuchillo y Richert Ultracut E microtomo. Recoger varias secciones en una rejilla de cobre.
12. Las rejillas son teñidas con acetato de uranilo al 3% saturada en etanol al 50% durante diez minutos y luego enjuagar tres veces con agua destilada. Entonces, las redes están manchadas con citrato de plomo (0.04gms disuelto en 10 ml de agua destilada doble y 100 ml de NaOH 10M) durante 2,5 minutos en una cámara que contiene gránulos de NaOH para crear un CO ₂ libre de medio ambiente. Las rejillas se lavaron tres veces con agua destilada.
13. Las secciones se examinaron con un microscopio electrónico JEOL 1200EX a 80kV, y se fotografiaron con una cámara digital de AMT.

Discussion

La morfogénesis del tubo cardíaco embrionario de Drosophila se ha convertido en un sistema modelo valioso para el estudio de la adhesión celular y cambios en las células forma durante el desarrollo embrionario. Uno de los desafíos que enfrentan en el estudio de esta estructura es que la luz del tubo cardíaco es difícil de visualizar en los embriones de montaje en su conjunto. La técnica se demuestra en este vídeo, que es una adaptación de los procedimientos anteriormente descritos ^1-2, ha demostrado ser exitoso en forma eficiente y fiable el análisis de un gran número de genotipos para el tubo de corazón y la formación del lumen ^3.