Summary
Descriviamo un processo di fissazione, inclusione, sezionamento, e l'imaging di stadio avanzato
Abstract
La morfogenesi della
Protocol
- Appena preparare 2 ml di una soluzione contenente fissativo 12,5% glutaraldeide in tampone cacodilato 50 mM (pH7.4) in un flaconcino da 20 ml di vetro scintillazione. Aggiungere 8 ml di n-eptano e agitare vigorosamente. Lasciare le due fasi separate. Rimuovere fase superiore contenente n-eptano satura di glutaraldeide, posto in una fiala di scintillazione pulito e messo da parte. Questa sarà la soluzione di fissativo.
- Raccogliere embrioni ore 0-20 utilizzando una camera di raccolta di embrioni, che è un piccolo cesto con inserto in rete asportabile. Rimuovere la membrana esterna corion immergendo embrioni in una soluzione di candeggina al 50% per 2-3 minuti, o fino a quando gli embrioni a galla della candeggina. Sciacquare abbondantemente con embrioni ddH20 e asciugare bene su un tovagliolo di carta.
- Utilizzando pinze, pick up inserto in rete che è coperto con embrioni dechorionated e posto nella soluzione di fissativo, permettendo embrioni a cadere dalla mesh. Lasciare embrioni per fissare per 1,5 ore a 4 ° C sotto agitazione in un Nutator.
- Preparare una capsula di Petri foderato con nastro biadesivo. Rimuovere gli embrioni dal fissativo utilizzando una pipetta Pasteur e metterli sulla superficie del nastro Petri dish.Transfer gli embrioni in una minima quantità di soluzione fissativo per evitare che il eptano nel fissativo da sciogliere la colla del nastro. Agitare la piastra Petri di fare un unico strato di embrioni. Posto in piastra Petri cappuccio fino evapora eptano. Aggiungi sufficiente Tween20 PBS + 0,1% per coprire gli embrioni. Mano devitellinize fine tappa 16 embrioni sotto un microscopio da dissezione con un ago di tungsteno smussato. Recuperare gli embrioni con una pipetta Pasteur in una provetta da microcentrifuga 1,5 ml. Passi 5-7 sono svolte in questo provetta per microcentrifuga.
- Sciacquare embrioni in cacodilato 0,1 M, pH 7.4 e poi post-fix in una soluzione contenente tetrossido di osmio 1% a 0,1 M cacodilato tampone, pH 7.4 per 1 ora a temperatura ambiente. Sciacquare embrioni con 0,1 M cacodilato tampone, pH 7,4.
- Disidratare embrioni in una serie graduata di etanolo e acetone. Disidratare embrioni con il 50% di etanolo per 10 minuti, seguito da etanolo al 70% per 10 minuti. Poi disidratano nel 90% acetone per 10 minuti, e due 100 passi% acetone di 10 minuti ciascuno.
- Rimuovere l'acetone e poi iniziare il processo di infiltrazione aggiungendo un Epon-Spurr 01:01 resina: miscela acetone per gli embrioni. Microonde per tre minuti con un forno a microonde Pelco Biowave Pro mantenendo il campione sotto pressione di vuoto. Applicare pressione di vuoto al campione per altri cinque minuti dopo che il forno a microonde è terminato. Scambio della resina 1:1, miscela acetone con il 100% Epon-Spurr resina e forno a microonde nuovo sotto pressione di vuoto. Il 100% di scambio Epon-Spurr resina l'ultima volta, e forno a microonde sotto pressione vuoto.
- Utilizzando una pipetta Pasteur, gli embrioni vengono trasferiti dalla provetta da microcentrifuga in uno stampo in silicone embedding. Allineare gli embrioni in una fila tale che l'estremità posteriore dell'embrione si allinea con il bordo dello stampo conico. Cuocere in forno a 70 ° C durante la notte.
- Rimuovere il campione e prepararsi per il sezionamento.
- Iniziare a tagliare sezioni 1μm utilizzando un diamante Histo coltello e Richert Ultracut E microtomo. Prendete nota di quando la sezione primo embrione viene raggiunto. Da questo punto tagliare 100μm nel campione. Rimuovere una sezione utilizzando un ciclo, e posto su un vetrino. Brevemente calore la sezione su un piatto caldo. Macchia la sezione con una goccia di blu di metilene. Sotto un microscopio ottico identificare il lume cuore.
- Tagliare sezioni 90nm usando un Ultra Diamante 45 ° coltello e Richert Ultracut E microtomo. Pick up più sezioni su una griglia di rame.
- Le griglie sono colorate con acetato di uranile 3% saturi in etanolo al 50% per dieci minuti e poi sciacquate tre volte in acqua bidistillata. Poi, le griglie sono colorate con citrato di piombo (0.04gms sciolto in 10ml di acqua bidistillata e 100 ml NaOH 10M) per 2,5 minuti in una camera contenente granuli di NaOH per creare un CO 2-ambiente libero. Le griglie sono lavata tre volte in acqua bidistillata.
- Le sezioni sono esaminati con un microscopio elettronico JEOL 1200EX a 80Kv, e fotografato con una fotocamera digitale AMT.
Discussion
La morfogenesi del tubo Drosophila cuore embrionale è emerso come sistema modello utile per studiare l'adesione cellulare e cambia la forma delle cellule durante lo sviluppo embrionale. Una delle sfide affrontate nello studio di questa struttura è che il lume del tubo cuore è difficile da visualizzare in embrioni di montare tutto. La tecnica ha dimostrato in questo video, che è stato adattato da procedure descritte in precedenza 1-2, ha dimostrato di essere efficace in modo efficiente e affidabile l'analisi di un notevole numero di genotipi per tubo cuore e la formazione lume 3.
Acknowledgments
Il nostro lavoro sulla formazione cuore tubo è stato supportato da una National Science Foundation Grant (Premio ID 0744165) per SGK
References
- Tepass, U., Hartenstein, V. The Development of Cellular Junctions in the Drosophila embryo. Dev. Biol. 161, 563-596 (1994).
- Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, S. Drosophila Protocols. , (2000).
- Santiago-Martinez, E., Soplop, N. H., Patel, R., Kramer, S. G. Repulsion by Slit and Roundabout prevents Shotgun/E-cadherin-mediated cell adhesion during Drosophila heart tube lumen formation. J. Cell Biol. 182, 241-248 (2008).
