Summary
ووصف مفصل لبروتوكول التصوير تشكيل الوقت الحقيقي من المجمعات في إصلاح الحمض النووي
Abstract
كل من بدائيات النوى وحقيقيات النوى لرد على الحمض النووي من التلف من خلال مجموعة معقدة من التغيرات الفسيولوجية. ويمكن حفز تغييرات في التعبير الجيني ، وإعادة توزيع البروتينات الموجودة ، والتجمع من البروتين مجمعات جديدة من جانب مجموعة متنوعة من آفات الحمض النووي وغير متطابقة أزواج قاعدة الحمض النووي. وقد تم استخدام المجهر مضان كأداة تجريبية قوية لتصور وقياس هذه وغيرها من الردود على آفات الحمض النووي DNA ، ورصد حالة النسخ المتماثل داخل البنية التحت خلوية معقدة للخلية الحية. وقد استخدمت متعدية اندماج بين البروتينات الفلورية مراسل ومكونات وآليات تكرار الحمض النووي لتحديد إصلاح العظة ان البروتينات التي تستهدف إصلاح الحمض النووي لهذه الآفات وما شابه ذلك
Protocol
تزايد الثقافات من الخلايا للفحص المجهري
1. واحد أو يومين قبل التصوير ، وإعداد B. سلالة الرقيقة التي تحتوي على البروتين الانصهار متعدية كنت ترغب في تصور. سوف جولات محاكمة 1A 1B الخطوات وتكون ضرورية لتحديد حالة النمو التي توفر أفضل الصور من سلالة الخاص بك. في معظم الحالات ، ينبغي تصوير الخلايا خلال مرحلة النمو المتسارع.
- بالنسبة لبعض B. سلالات الرقيقة (في السلالات ، ولا سيما التي تنمو بشكل سيئ نتيجة لاندماج بين الانصهار متعدية الجينات في المصالح وGFP في مكان به الذاتية) ، والنمو الأولي لمدة يومين قبل التصوير ضروري للصور ذات جودة عالية. في اليوم الأول ، على خط باء الرقيقة إلى سلالة يمكن تصوير أغار على LB مع المضادات الحيوية الانتقائية (ق) ، واحتضان بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية. في اليوم الثاني ، تطعيم 100 ميكرولتر من المياه المالحة 0.85 ٪ مع مستعمرة واحدة وأداء ثلاث التخفيفات التسلسلي 10 أضعاف على لوحات أجار LB (مع المضادات الحيوية الانتقائية) ، والطلاء 100 ميكرولتر من كل التخفيف ، وتليها الحضانة بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية. في اليوم الثالث ، حدد لوحة التخفيف مع النمو متموجة ضوء الخلايا. وسيكون معدل النمو متموجة الضوء على طبق تقديم المتوسطة النمو مع قيحة صحية ، وبدء تزايد أضعافا مضاعفة العائد المحتمل نتائج التصوير الممتاز (راجع الخطوة 4). هذه الخطوة هي مفيدة بشكل خاص للتصوير بجودة أعلى الغشاء مع 64 FM4 وصمة عار.
- باء أخرى ببساطة قد الرقيقة سلالات انتقائية تطبق على LB المتوسطة أغار على المستعمرات واحدة بعصا العقيمة في اليوم قبل التصوير واحتضان ليلا 30 درجة مئوية. في اليوم التالي ، والخلايا على هذا الطبق يكون كافيا لاستخدامها كعامل قيحة للتصوير (راجع الخطوة 4).
ملاحظة : للحصول على B. الرقيقة والثقافات بين عشية وضحاها في المتوسط السائل ليست مناسبة بسبب وجود مزيج من تشكيل بوغ والاستجابات النصاب القانوني ، والذي يؤدي لفترة طويلة من النمو مرحلة متخلفة 1.
2. في صباح يوم من التصوير ، ووضع 10 مل من المتوسط 50 S7 1-3 في قارورة 125 مل مخروطي العقيمة.
3. Resuspend الخلايا في لتصل إلى 2 مل من المتوسط من 50 S7 LB طبق آغار مع واحد أو مستعمرات الخلايا ضوء متموجة للحصول على اللقاح.
4. إضافة ما يكفي من S7 50 خلية متوسطة قيحة إلى دورق مخروطي يحتوي على 10 مل 50 S7 المتوسطة لثقافة ذات الكثافة الضوئية الأولي تقاس في 600 نانومتر (OD 600) من ~ ،08-،1. في هذه الخطوة من المهم أن يكون ما لا يقل عن 10 الهواء أضعاف لتصل إلى نسبة متوسطة. وبالتالي ، فإننا نستخدم 10-12،5 مل من المتوسط تلقيح في دورق مخروطي 125 مل.
5. تنمو كل ثقافة في 30 درجة مئوية حتى يصل إلى ثقافة OD 600 ~ 0،5-0،8. ويفضل حمامات المياه تهتز مع الثورات في الدقيقة الواحدة 150-200. وينبغي أن الثقافات تحدى مع وكلاء حمل الحمض النووي تلف أو عدم تطابق تكون في مرحلة النمو المتسارع في وقت مبكر من هذا القبيل 600 OD أن الخلايا ستصل إلى الهدف OD 600 مع الفترة الإضافية للنمو المطلوب للعلاج (انظر الجدول رقم 1)
على سبيل المثال ، 2 - aminopurine يتطلب ساعة واحدة من العلاج ، ولذا تعامل مع ثقافة aminopurine - 2 ينبغي أن تكون في OD 600 ~ 0،3-0،4 ، على ان يكون ساعة واحدة من العلاج / نتائج النمو في OD 600 ~ 0،5-0،8 ، حيث الخلايا جاهزة للتصوير.
تحضير العينة
1. ماصة 300 ميكرولتر من الخلايا المستزرعة في أنبوب مل microcentrifuge 1.5.
2. إذا كان المطلوب تصوير الأغشية الخلوية ، إضافة 1:1000 تخفيف FM4 - 64 غشاء صمة عار (Invitrogen) لكل عينة من حل سهم 1 ملغ / مل. قد تكون هناك حاجة لمعايرة 64 FM4 لتحقيق إشارة مضان المطلوب. مجموعة المعايرة النموذجية 1:100 ، 1:1000 ، و1:10،000.
3. السماح لعينات من الجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى عشر دقائق أو حين يجري إعداد الشريحة مع agarose 1 ٪ في المتوسط Spizizens 1X كما هو موضح أدناه (راجع الخطوة 1 من "إعداد الشرائح").
4. إذا كان المطلوب التركيز من الخلايا ، ونحن نفضل تصفية الخلايا باستخدام ميكرومتر 0.2 فلتر مع جهاز فراغ. ويمكن عندئذ أن تغسل الخلايا بلطف من سطح المرشح مع برنامج تلفزيوني ، آخر العازلة المناسبة أو متوسطة قبل التصور.
إعداد الشريحة
1. إعداد agarose 1 ٪ مع 1X Spizizens.
إضافة 5 مل من الأسهم لddH2O Spizizens 10X 45 مل مع agarose ز 0.5 ، والميكروويف لتذوب. agarose المنصهرة الساخنة يصعب ماصة ، وطدت agarose لن تدخل طرف ماصة. ينبغي أن يكون agarose معايرتها في حمام الماء إلى درجة حرارة من 55-65 درجة مئوية ~ لكي تدخل طرف ماصة دون ترسيخ داخل الحافة.
2. رسم ميكرولتر من 20 Spizizens مع agarose ذاب 1 ٪ في تلميح ماصة. ماصة قطرة واحدة (حوالي 1-2 ميكرولتر) من الحل agarose في كل شريحة جيدا (15 نستخدمها بشكل جيد الشرائح ، انظر الجدول رقم 2) لتشكيل منصات agarose الضحلة. سوف يصلب agarose على الفور. ويجب أيضا أن يتم قبل الشرائح فورا إلى تطبيق الخلايا. إذا ترك وسادات agarose في درجة حرارة الغرفة وحدها ، فإنها يمكن أن يذوى في غضون دقائق وتصبح غير صالحة للاستعمال.
وينبغي أن تتركز منصات Agarose وملء كل بئر ولكن ارتفاع الحد الأدنى لتجنب تعطيل ساترة ، وإذا قطرات مرتفعة جدا (مثل فقاعة) أو إذا كان نموذج ينتشر ما وراء الحدود بشكل جيد ، انتقد ببساطة نظيفة بشكل جيد مع Kimwipe وتطبيق منصة جديدة agarose.
3. تطبيق كامل 300 عينة ميكرولتر (راجع الخطوة 6) إلى الشريحة ، وزعت على رأس كل وسادة agarose. وينبغي أن هذا المبلغ من الخلايا تكون كافية لتغطية كل بئر على الشريحة.
4. السماح للشريحة محملة الخلايا على الجلوس في درجة حرارة الغرفة (23 درجة مئوية) لنحو عشر دقائق. وهذه الخطوة تسمح للخلايا ليستقر على منصة متحركة وagarose تصبح جاهزة للتصوير. لتلبية الاحتياجات المتخصصة درجة الحرارة هذه قد تحتاج إلى تغيير ، على سبيل المثال ، عند إجراء التجارب التي تتطلب تحولا في درجة الحرارة 4.
5. نضح بعيدا المتوسطة الزائدة من كل جانب دون إزالة منصات أنفسهم.
6. تطبيق ساترة إلى الشريحة ، والضغط بقوة وبشكل متساو ، ولكن بلطف ، وعبر مساحة الشريحة. تحقق للتأكد من أن تنزلق الغطاء ضد الشريحة والتي لم يتم رفع الغطاء ينزلق فوق الشريحة.
التصور من الخلايا
1. فإن العديد من المجاهر مضان مختلفة تعمل بشكل جيد. فمن الأهمية بمكان أن يكون الانغماس النفط 100X العدسة. يستخدم مختبر سيمونز :
- اوليمبوس BX61 المجهر مجهزة 1،45 NA النفط 100X TIRFM عدسة الهدف الغمر
- تبريد هاماماتسو ORCAR 2 كاميرا CCD
- تجويف معدني قوس 200 (قبل) مصدر الضوء.
- للكشف عن GFP (FITC) ، تصفية الإثارة وانبعاث 460-500 510-560
- للكشف عن 64 FM4 (TRITC) ، 510-560 تصفية الإثارة وانبعاث 572-648.
- تم القبض على الصور باستخدام SlideBook 4.2 (الشكل 1)
2. جعل الخلايا في التركيز باستخدام الضوء الأبيض.
3. التقاط الصور باستخدام المرشحات المناسبة لكل fluorophore.
ممثل النتائج
وتظهر الصور ممثل (الشكل 1). وينبغي أن تحدد بؤر GFP جيد ، في حين FM4 - 64 تلطيخ ينبغي أن يكون مشرقا وواضحا 4-7. يمكن GFP أو الغشاء تكون الصور الملونة الزائفة مع أي لون ، للسماح للصورة عالية الجودة لتقديمها دون فقدان أية بيانات.
الشكل 1 : صور الممثل GFP باء وترد الرقيقة البروتينات الانصهار متعدية. البروتينات GFP باللون الأخضر ، في حين أظهرت تلطيخ FM4 غشاء - 64 باللون الأحمر. شريط النطاق الأبيض يشير 3 ميكرومتر (A) MutS - GFP [الوراثي ذات الصلة : mutS -- GFP (SPC) ، amyE : Pspac mutL (القط)]. في وجود 600 ميكروغرام / مل 2 و 1 aminopurine IPTG ملم. لم يتم تقديم FM4 - 64 في إشارة إلى النظام أكثر وضوحا تظهر بؤر MutS - GFP (B) MutL - GFP [الوراثي ذات الصلة : mutL : mutL - GFP (SPC)].. في وجود aminopurine - 2 (C) DnaX - GFP [الوراثي ذات الصلة : dnaX : dnaX - GFP (SPC)]. (D) RecA - GFP [الوراثي ذات الصلة : recA : recA - GFP (SPC)] في وجود من 20 نانوغرام / مل mitomycin C. (E) - TagC GFP [الوراثي ذات الصلة : tagC : tagC - GFP (SPC) ] في وجود من 1 ميكروغرام / مل جيم mitomycin
| المعاملة / الاعتقال أو مقدار | وظيفة | وقت الحضانة |
| Mitomycin C (MMC) [20-150 نانوغرام / مل] | الحمض النووي عامل مؤلكل | 1 ساعة |
| 2 - aminopurine (2 - AP) [600 ميكروغرام / مل] | تطابق حمل | 1 ساعة |
| هيدروكسي يوريا (HU) | يستنزف dNTPs | 3 ساعات |
| الأشعة فوق البنفسجية (UV) 20 J/m2 | الثايمين ، والثايمين dimers برومة 6-4 | تختلف تبعا للمصدر ، وعادة 20 ثانية |
| الرمادي (الإشعاع المؤين) 5-100 غراي | فواصل حبلا مزدوجة ، فواصل حبلا واحدة وقاعدة الضرر المواقع | تختلف تبعا للمصدر |
| اسم كاشف | شركة | فهرس العدد | تعليقات (اختياري) |
| Multitest الشريحة ، كذلك 15 | النائب Biomedicals | 6041505E | |
| مجهر غطاء زجاج | الصياد | 12-544 - B | |
| Agarose | الصياد | BP160 - 500 | |
| Mitomycin C | سيغما | M0503 - 2MG | المغير ، والقفازات ارتداء |
| 2 - Aminopurine | سيغما | A3509 - 250MG | قفازات |
| هيدروكسي يوريا | سيغما | H8627 - 25G | قفازات |
| FM4 - 64 | Invitrogen | T13320 | ضوء حساسية |
الجدول 2. قائمة محددة من الكواشف والمعدات :
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
مطلوبة التجربة والخطأ لإيجاد ظروف التعرض للصور عالية الجودة لكل سلالة ، نجد أن 1 ميلي ثانية واحدة غير مناسبة للصور الضوء الأبيض ، في حين أن التعرض لل100-2000 مللي المناسبة لGFP (FITC) وFM4 64 (TRITC ) الصور. وزمن التعرض تختلف تبعا لمعدات التصوير المستخدمة. نوصي باستخدام سلالة واحدة لكل شريحة المجهر 15 - جيدا لأبسط التصوير ، ونوعية اللوحة ونشر الخلايا من الحدود منصة يمكن ان يعقد اذا تمايز سلالة سلالات متعددة موجودة على الشريحة نفسها. جودة الصورة تعتمد بشكل مباشر على نوعية لوحة agarose فيها البكتيريا هي الراحة. وسيتم التقاط صور عالية الجودة من حيث منصات agarose البكتيريا جنبا إلى جنب. منصات التي تتسبب في الخلايا البكتيرية إلى أجمة ، منع أحادي الطبقة ، وسوف تنتج صورا الفقراء. سوف منصات سميكة جدا التي تنتج إشارة عالية الفلورسنت الخلفية ، في حين أن منصات المجففة لن تسمح للخلايا للراحة بشكل صحيح. وهذه العيوب لوحة agarose نتيجة عادة في جودة الصورة سيئة للغاية. إذا كان كذلك تنتج الصور الفقيرة ، وتنتقل الى المرحلة التالية أيضا. انها مثالية لالتقاط ما بين 50 و 200 خلية لكل صورة. وقد وفرت المجهري مضان ثروة من المعلومات التي تفصل الاشارات الخلوية التي توجه التجمع للإصلاح الحمض النووي والبروتينات المتماثل في البؤر في الجسم الحي. مع الممارسة ، ويمكن تطبيق هذه التقنية بنجاح لمجموعة متنوعة من مجمعات البروتين في العديد من الأنواع البكتيرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
الكتاب نود أن نشكر الدكاترة. Philina س. لي وألان غروسمان دال للتدريب في البداية في LAS المجهري مضان. الكتاب أيضا أن أشكر الدكاترة. ميلاني Berkmen كوباياشي وهاجيمي طلبا للمساعدة ونصائح للتصوير. وأيد هذا العمل عن طريق بدء الأموال من كلية الآداب والعلوم والآداب والعلوم من قسم علم الأحياء الجزيئية والخلوية والتنموية في جامعة ميشيغان.
Materials
| Specific solution recipes1: | |||
| 10x S750 salts 0.5 M MOPS 100 mM Ammonium Sulfate 50 mM Potassium Phosphate Monobasic Filter sterilize, and wrap S750 media in foil prior to storage |
|||
| 100x Metals 0.2 M MgCl2 70 mM CaCl2 5 mM MnCl2 0.1 mM ZnCl2 100 μg/mL Thiamine HCl 2 mM HCl 0.5 mM FeCl3* dH2O to final volume *FeCl3 should be added last, to prevent precipitation. After filter sterilization, wrap 100x Metal solution in foil. |
|||
| S750 media 1x S750 salts 1x Metal 1% Glucose 0.1% Glutamate 40 μg/mL Tryptophan 40 μg/mL Phenylalanine distilled H2O to final volume |
|||
| 10x Spizizens (grams/L) 151.4 mM Ammonium Sulfate (20g/L) 803.8 mM Potassium Phosphate Monobasic (140g/L) 440.9 mM Potassium Phosphate Dibasic (60g/L) 34.0 mM Sodium Citrate (10g/L) 16.6 mM MgSO4 (2g/L) dH2O to final volume Filter sterilize |
References
- Hardwood, C. R., Cutting, S. M. Molecular Biological Methods for Bacillus. , John Wiley and Sons. Chichester. (1990).
- Berkmen, M. B., Grossman, A. D. Spatial and temporal organization of the Bacillus subtilis replication cycle. Mol. Microbiol. 62, 57-71 (2006).
- Simmons, L. A., Grossman, A. D., Walker, G. C. Clp and Lon proteases occupy distinct subcellular positions in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 190, 6758-6768 (2008).
- Simmons, L. A., Grossman, A. D., Walker, G. C. Replication is required for the RecA localization response to DNA damage in Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 104, 1360-1365 (2007).
- Simmons, L. A., Davies, B. W., Grossman, A. D., Walker, G. C. b Clamp Directs Localization of Mismatch Repair in Bacillus subtilis. Mol. Cell. 29, 291-301 (2008).
- Simmons, L. A. Comparison of responses to double-strand breaks between Escherichia coli and Bacillus subtilis reveals different requirements for SOS induction. J. Bacteriol. 191, 1152-1161 (2009).
- Smith, B. T., Grossman, A. D., Walker, G. C. Visualization of mismatch repair in bacterial cells. Mol. Cell. 8, 1197-1206 (2001).
