הכנת מועכת תסיסנית Polytene כרומוזום עבור סימון נוגדן

Summary

זה פרוטוקול וידאו ממחיש את הטכניקה סקווש המשמשים את המעבדה יוהנסן להכין

Abstract

תסיסנית כבר זמן רב במערכת מודל האהוב לחקר הקשר בין מבנה הכרומטין ויסות הגנים, בשל היתרונות ציטולוגית הניתנים על ידי ענקי הרוק polytene הכרומוזומים של בלוטת הזחלים instar השלישי. ברקמת זה הכרומוזומים לעבור סיבובים רבים של שכפול בהעדר חלוקת התא והוליד כ 1,000 עותקים. ה-DNA נשאר מיושר לאחר כל מחזור replicative וכתוצאה מכך הכרומוזומים מוגדלים מאוד אשר מספקים הזדמנות ייחודית, כדי לקשר בין המורפולוגיה הכרומטין עם לוקליזציה של חלבונים ספציפיים. כתוצאה מכך, חלה על רמה גבוהה של עניין בהגדרת שינויים epigenetic נוכח גנים שונים בשלבים שונים של תהליך השעתוק. כלי חשוב עבור מחקרים כאלה הוא תיוג של כרומוזומים polytene עם נוגדנים האנזים, גורם שעתוק, או שינוי היסטון של עניין. זה פרוטוקול וידאו ממחיש את הטכניקה סקווש המשמשים את המעבדה יוהנסן להכין תסיסנית הכרומוזומים polytene תיוג נוגדן.

Protocol

פרוטוקול הבאים להכנת כרומוזום polytene סקווש מותאמת ההליך המתואר יוהנסן et al. (2009).

1. תרבות של הזחלים third תסיסנית instar

על מנת לקבל את הכרומוזומים polytene האופטימלי עבור ההכנות סקווש באיכות גבוהה, תנאים culturing צפוף חיוניים (כלומר, סביב מקום 20 ההטלה זבובים הנשי בקבוק סטנדרטי "4 לעוף שינוי בקבוק חדש בכל יום). בחר את האנשים השמנים ביותר מן היבול הראשון של טיפוס 3 זחלים instar בזמן שהם עדיין משוטטים אך זמן קצר לפני התגלמות. אנו שגרתי תרבות ב 21 ° C 18 ° C אך תניב הכרומוזומים שמנים שעשויים להיות מתאים יותר למטרות מסוימות כמו למשל כאשר הלהקה / אזורים interband צריך להיות דמיינו ברזולוציה גבוהה.

2. קישואים חומרים Polytene

• דראמונד מלקחיים דיסקציה (2)
• צלחות פטרי (60 x 15 מ"מ)
• מסוכרים שקופיות מיקרוסקופ (פישר מס '12-544-3) (poly-ליזין מצופה)
• 22 x 22 מ"מ מס '15 מכסה מחליק (פישר מס' 12-520B) (מצופה Sigmacote: Sigma # SL2)
• 22 x 40 מ"מ 15 מס 'מכסה מחליק (פישר מס' 12-530B)
• קים, מגבונים
• בניגוד שלב מיקרוסקופ במטרה 20X
• דיואר קטנים (למשל, תרמוס תרמוס או בקבוק)
• לונג מלקחיים
• סכיני גילוח
• Coplin צנצנת
• גומי Maid או מגש טאפרוור (או מגש סגר שווה ערך)
• Parafilm (חתך לתוך ריבועים 22 מ"מ)
• 175 גרם משקולות

3. Fixatives ופתרונות

1. מניות פורמלדהיד 5X. הכן פתרון חדש של 0.74 גרם paraformaldehyde ב 4.0 מ"ל של DH ₂ O עם 28 μl של 1N KOH. חם עד 65 ° C לפזר את paraformaldehyde ולאחר מכן לאחסן על הקרח.
2. מקבע 1. הכן פתרון חדש של 0.5 מ"ל PBS 10X, 50μl טריטון X-100, 3.45 מ"ל DH ₂ O ו - 1.0 מ"ל ממלאי פורמלדהיד 5X. חם לפזר את טריטון X-100 ולהשתמש תוך שעה 1.
3. מקבע 2. הכן פתרון חדש של 1.5 מ"ל DH ₂ O, 2.5 מ"ל חומצה אצטית קרחונית, ו 1.0 מ"ל ממלאי פורמלדהיד להשתמש 5X ו תוך שעה 1.
4. חומצה Lactoacetic פתרון. הכן תמיסה של חומצה לקטית 1 מ"ל, 2 מ"ל DH ₂ O, ו - 3 מ"ל חומצה אצטית.

4. סקווש Polytene כרומוזום הכנה:

1. לשטוף עם מים זחלים להעביר PBS בצלחת רקמה תרבות לנתיחה.
2. אחוז את קצה הפה קרסים עם זוג אחד של מלקחיים, להחזיק את הגוף בערך 2 / 3 הדרך למטה עם זוג אחר, ולמשוך על פיו ווים כך בלוטות הרוק חשופים. הפרד את בלוטות הרוק מהמוח את העין מחושים דיסקים, לנתח משם את השומן בגוף וכל הרקמות הקשורים אחרים מבלוטות.
3. הוסף 200 מיקרוליטר של מקבע 1 עד הבאר הראשונה של השקופית שני דיכאון היטב 200-300 מיקרוליטר של 2 מקבע היטב השניים. העברת זוג אחד של בלוטות הרוק בכל פעם עד 1 מקבע היטב אחד לדגור על כמות הזמן הדרוש epitope היעד, בדרך כלל כ - 1-2 דקות. (הערה: כמה epitopes, כמו רוב השינויים היסטון, עשויה לדרוש 5 דקות או קיבעון יותר.)
4. שימוש במלקחיים להעביר את בלוטות הרוק עד 2 מקבע היטב 2 ו דגירה במשך שתי דקות.
5. מעבירים את בלוטות ל μl 10-30 של פתרון חומצה Lactoacetic על coverslip Sigmacoted נקי. בעדינות נמוך שקופיות polylysine מצופה מיקרוסקופ על coverslip ו, ללא הפעלת לחץ אנכי, להרים את בלוטות coverslip כך הם בין השקופיות לבין coverslip. להקל מיד תמוגה התא כרומוזומליות להפיץ בקפידה על ידי לתפוס את coverslip עם מלקחיים על קצה אחד בעדינות להעביר אותו מעט קדימה ואחורה, מנסה למזער את הלחץ האנכי על הרקמה. לחילופין להשתמש בצד מחק של עיפרון או אפילו האצבע להזיז בעדינות את coverslip קדימה ואחורה. שים לב כי כל עיכוב בהעברת coverslip הלוך ושוב צפוי לצמצם הפצת הנשק כרומוזומליות כמו שהם נוטים להיות נוקשה יותר בחשיפה הפתרון חומצה Lactoacetic. ערפול של הפתרון הוא בדרך כלל אינדיקציה טובה ההפרדה התא. בעדינות הקשה coverslip באלכסון (כדי למנוע לחץ אנכי) עם הצד במחק של עיפרון כמה פעמים יכול גם לסייע בהפצת כרומוזומליות.
6. מיד לבדוק את הרקמה תחת מיקרוסקופ שלב לעומת יעד של 20 40X או כדי לקבוע אם הכרומוזומים היטב להתפשט.
7. כאשר כרומוזומליות הפצת מספיק, להגדיר את השקופית עם הצד coverslip על ערימה של קים נקי, מגבונים. המקום השני קים-למחות על גבי ולשטח כרומוזומים על ידי הנחת האצבע על איפה coverslip ממוקם ולחיצה בתקיפות, להימנע מכל תנועה אופקית של coverslip כי היה גזירההכרומוזומים.
8. בדוק את השקופית שוב תחת מיקרוסקופ כדי לקבוע אם התכשיר מתאים למטרה המיועדת. אם הכרומוזומים עברו באופן משמעותי על מועך, להשתמש פחות נפח של תמיסת חומצה Lactoacetic בהכנות הבאים שלך. חזור על שלבים עד 4.1-4.8 מספר מספיק של שקופיות מתאים הושגו. מקום 175 גרם משקולות על coverslip של השקופיות.
9. מילוי דיואר קטן (למשל, בקבוק תרמוס) עם חנקן נוזלי. בעזרת מלקחיים ארוכים, לטבול להחליק לתוך הנוזל N ₂ עד מפסיק רותחים, להסיר שקופיות, ומיד להשתמש בקצה של סכין גילוח נקי בפינה אחת כדי להפוך את coverslip. אם השקופית ישמש באופן מיידי, מקום בצנצנת Coplin עם PBS ב 4 ° C. אחרת לגבות את השקופית לתוך צנצנת Coplin מלא אתנול 95%. בדוק את coverslip פעם כפור יש בסובלימציה ממנו לאשר כי הרקמה דבק לשקופית ולא להישאר עם coverslip. חזור עם שאר השקופיות עד כל השקופיות מאוחסנים או PBS (לשימוש בתוך מספר שעות) או אתנול (עבור אחסון לטווח ארוך יותר).

נציג תוצאות

הצעד הקריטי הראשון עבור השגת איכות גבוהה polytene הכנה סקווש הוא לגדול הזחלים שומן עם גרעין גדול בלוטת הרוק. השנייה היא טכניקה טובה עם ההליך להפיץ, אשר עשוי לקחת חלק באימון. טיפ להצלחה הפצת משופרת היא למצוא את נפח מינימלי של פתרון חומצה lactoacetic במהלך השלב מועך. זו תקדם מספיק להפיץ הכרומוזומים מבלי ליצור כוחות זרימה מוגזמת שיכולה לשטוף ידיים כרומוזום משם. זה גם ראוי לציין כי כל עיכוב בהעברת coverslip הלוך ושוב תפחית הפצת הנשק כרומוזומליות כאשר הם הופכים נוקשים יותר כאשר הם נחשפים הפתרון חומצה Lactoacetic.

אם הכל ילך כשורה, צריך להיות רבים הכרומוזומים polytene להפיץ היטב. איור 1 מציג דוגמה של הכנה כזו, שכותרתו כפול עם כסמן לאזורים interband בירוק עם צבע כי כתמים באזורים התאגדו בכחול. אם הפצת מספיק מתקבל, הכרומוזומים ייראה כדורים קטנים, כפי שמוצג באיור 2. מצד שני, אם יותר מדי מתפשט התרחש, chomosomes תהיה רזה מדי המורחבת או במקרים מסוימים מקוטעת לחתיכות קטנות כפי שמוצג באיור 3.

1. איור הכנה Polytene סקווש שכותרתו כפול עם נוגדנים קינאז H3S10 ז'יל-1 היסטון (באדום) ו Hoechst (כחול).

2. איור Polytene סקווש עם הפצת מספיק.

איור 3. סקווש Polytene עם יותר מדי מתפשט.

Discussion

הכללתו של חומצות אצטית לקטית פרוטוקולים קיבעון קונבנציונאלי סקווש מקלה הן ברזולוציה interband והזרוע כרומוזומליות מתפשטת אך למרבה הצער epitopes כמה אינם שורדים את הטיפול הזה. דוגמה epitope כזה היא H3S10ph (Cai et al. 2008). מאז הטיפול בחומצה יש גם חיסרון, כי זה מרווה את הקרינה הפנימית של ה-GFP-tagged חלבונים, DiMario et al. (2006) לאחרונה פיתח משחררי פורמלדהיד "נטול חומצה טכניקה סקווש" המאפשרים להדמיה ישירה של חלבון ה-GFP-Fusion על כרומוזומים polytene ללא תיוג GFP-נוגדנים, כמו גם לגילוי נוגדנים של חומצה רגיש epitopes. שינויים עבור הליך זה מתוארים נוספת יוהנסן ואח' בפירוט. (2009). חומצה נציג קבוע polytene סקווש הכנה שכותרתו כפול עם נוגדנים ל ז'יל-1 היסטון H3S10 קינאז ו Hoechst מוצג באיור. 1.