Summary
이 비디오 프로토콜은 준비하는 요한센 실험실에서 사용되는 스쿼시 기법을 보여줍니다
Abstract
Drosophila 오래 염색질 구조와 셋째 instar의 애벌레의 거대한 침샘 polytene 염색체에서 제공하는 cytological 장점으로 인해 유전자 규제 사이의 관계를 공부 좋아하는 모델 시스템을하고 있습니다. 이 조직에서 염색체는 약 1000 사본을 상승을주는 세포 분열의 부재에서 복제의 많은 순찰을 받고있다. DNA는 특정 단백질의 지방화로 염색질 형태를 상호 연관시킬 수있는 독특한 기회를 제공합니다 크게 확대 염색체의 결과로 각 replicative 사이클 이후에 정렬 남아있다. 따라서, 다른 유전자에 존재하는 epigenetic 수정 정의 및 전사 프로세스의 여러 단계에서 관심이 높은 수준이되었습니다. 이러한 연구에 중요한 도구가 효소에 항체와 polytene 염색체의 라벨, 전사 인자, 또는 관심 히스톤 수정입니다. 이 비디오 프로토콜은 항체 라벨에 대한 Drosophila polytene 염색체를 준비 요한센 실험실에서 사용되는 스쿼시 기술을 보여줍니다.
Protocol
polytene 염색체 스쿼시 준비에 대해 다음 프로토콜은 요한센 외에서 설명한 절차에서 조정됩니다. (2009).
1. 셋째 instar Drosophila의 애벌레의 문화
고품질 스쿼시 준비를위한 최적의 polytene 염색체를 얻기 위해서는, 솟아 culturing 조건 (즉, 주위 20 달걀 누워 매일 새로운 병에 표준 4 "비행 병 및 변경에 여성 파리). 선택 뚱보 개인 필수입니다 그들은 아직도 방황하고 있지만 pupation하기 직전하는 동안 세번째 instar의 유충을 등반의 첫 번째 작물에서. 21 우리는 정기적으로 문화 ° C 있지만 18 ° C 예를 들어 같은 몇 가지 목적을 위해 더 적합 있습니다 오르게 염색체를 얻을 것이다 때 밴드 / interband 지역은 높은 해상도 시각해야합니다.
2. Polytene 스쿼시 자료
- 드루먼드 해부의 포셉 (2)
- 페트리 요리 (60 X 15mm)
- 프로스트 현미경 슬라이드 (피셔 번호 12-544-3) (폴리 - 라이신 - 코팅)
- 22 X 22mm 번호 15 커버 전표 (피셔 번호 12 520B) (Sigmacote와 코팅, 시그마 # SL2)
- 22 X 40mm 번호 15 커버 전표 (피셔 번호 12 - 530B)
- 김 - 쳐줍니다
- 20X 목적으로 위상 대비 현미경
- 소형 듀어 (예 : 진공 플라스크 또는 보온병 병)
- 롱 포셉
- 면도날
- 코플린 잘
- 고무 메이드 또는 유리 섬유 복합 트레이 (또는 이와 동등한 sealable 트레이)
- Parafilm (22mm 사각형으로 절단)
- 175g의 무게
3. Fixatives 및 솔루션
- 배 포름 알데히드 주식. 0.74 G.의 새로운 솔루션을 준비 DH 2 O의 4.0 ML과 1N 코 28 μl로 paraformaldehyde. 65 따뜻한 ° C paraformaldehyde를 해산하고 얼음에 저장합니다.
- 정착액 1. 배 포름 알데히드 주식의 0.5 ML 10X PBS, 50μl 트리톤 X - 100, 3.45 ML DH 2 O 및 1.0 ML의 새로운 솔루션을 준비합니다. 트리톤 X - 100을 분산하고 1 시간 이내에 사용하는 웜.
- 정착액 2. 1.5 ML DH 2 O, 2.5 ML 빙초산, 1 시간 이내에 배 포름 알데히드 재고 및 사용에서 1.0 ML의 새로운 솔루션을 준비합니다.
- Lactoacetic 산성 솔루션입니다. 1 ML 젖산, 2 ML DH 2 O, 3 ML 초산의 솔루션을 준비합니다.
4. Polytene의 염색체 스쿼시 준비 :
- 물을 애벌레를 씻어 해부를위한 조직 문화 접시에있는 PBS로 전송할 수 있습니다.
- , 입 포셉 한 쌍의와 후크의 팁을 파악 다른 페어와 방법 아래의 2 / 3에 대한 본문을 보유하고 입으로 당겨 침샘이 노출되도록 후크. 타액 두뇌에서 분비와 눈 - antennal 디스크를 분리하고,이 선들의 지방 신체 및 기타 관련 조직 멀리 해부하다.
- 두 잘 우울증 슬라이드 잘 첫 번째와 정착액 2 200-300 microliters 잘 두 정착액 1 200 microliters를 추가합니다. 물론 하나의 정착액 1 번에 침샘 중 하나 쌍을 전송하고 일반적으로 1-2분에 대한 대상 에피토프에 필요한 시간의 금액에 대해 숙고하다. (참고 : 같은 히스톤 수정의 대부분 같은 epitopes가 5 분 이상 고정이 필요할 수 있습니다.)
- 사용 포셉 잘 2 정착액 2 침샘을 전송하고 2 분 동안 품어.
- 깨끗한 Sigmacoted coverslip에 Lactoacetic 산성 솔루션의 10-30 μl에 분비를 전송합니다. 부드럽게 coverslip에 polylysine - 코팅 현미경 슬라이드를 낮추고,이 선들은 슬라이드와 coverslip 사이 있도록 수직 압력을 적용하지 않고, coverslip을 선택합니다. 즉시 조심스럽게 한쪽 가장자리에 집게로 coverslip 쥐고하여 확산 세포 용해와 염색체를 촉진 그리고 부드럽게 조직에 대한 수직 압력을 최소화하기 위해 노력하고, 약간 앞뒤로 그것을 이동. 또는 부드럽게 앞뒤로 coverslip을 이동에도 지우개 연필의 측면이나 손가락을 사용합니다. 앞뒤로 coverslip 이동에 지연 그들이 Lactoacetic 산성 용액에 노출시보다 엄격한되는 경향이 있으므로 염색체 무기의 확산 감소 가능성입니다. 솔루션의 혼돈 스럽 것은 종종 세포 분리의 좋은 표시이다. 부드럽게 몇 번 염색체 확산을 지원 또한 연필의 지우개 측면 (수직 압력을 피하기 위해) obliquely coverslip을 수 도청.
- 즉시 염색체가 잘 확산한지 여부를 확인할 20 40X 목적으로 위상 대비 현미경으로 조직을 검사합니다.
- 확산 염색체가 충분하면 깨끗한 김 - 잎사귀의 스택에 다운 coverslip 측면으로 슬라이드를 설정합니다. 플레이스 두 번째 위에 김 - 닦아 및 전단 것이다 coverslip의 수평 운동을 피하 coverslip가 위치하고 단단히 눌러 어디 위에 엄지를 배치하여 염색체를 평평하게염색체.
- 준비가 용도에 적합한지 확인하기 위해 현미경으로 다시 슬라이드를 검사합니다. 염색체가 부수에 따라 크게 이동하는 경우 후속 준비에 Lactoacetic 산성 솔루션의 적은 볼륨을 사용합니다. 적합한 슬라이드 충분한 번호가 얻은 때까지 반복 4.1-4.8 단계를 반복합니다. 슬라이드의 coverslip에 175g 무게를 놓습니다.
- 액체 질소로 작은 듀어 (예, 보온병 병) 채웁니다. 긴 집게를 사용하여 액체 N 2로 수영 슬라이드 끓는 멈출 때까지, 슬라이드를 제거하고 즉시 coverslip을 뒤집기 한 모퉁이에 깨끗한 면도날의 가장자리를 사용합니다. 4 PBS와 코플린있는 항아리에 슬라이드가 즉시 사용할 수있다면, 장소 ° C. 그렇지 않으면 95 % 에탄올로 가득 코플린 병에 슬라이드를 수집합니다. 서리가 조직 슬라이드에 준수하여 coverslip로 남아 않았 확인 멀리 sublimed 일단 coverslip을 검사합니다. 모든 슬라이드는 PBS (몇 시간 이내에 사용하기 위해) 또는 에탄올 (장기 저장을 위해) 중 하나에 저장된 때까지 슬라이드의 나머지와 함께 반복합니다.
대표 결과
고품질 polytene 스쿼시 준비를위한 첫 번째 중요한 단계는 큰 침샘과 핵 지방 애벌레를 성장하는 것입니다. 두 번째는 연습이 걸릴 수 있습니다 확산 과정과 좋은 기술입니다. 개선 확산 성공 한 팁은 부수 단계에서 lactoacetic 산성 솔루션의 최소한의 볼륨을 찾을 수 있습니다. 이것은 멀리 염색체 팔이 씻을 수있는 과도한 스트리밍 군대를 생성하지 않고 염색체의 확산 충분한을 촉진합니다. 또한 Lactoacetic 산성 용액에 노출 때 그들이 더 엄격한 해짐에 따라 앞뒤로 coverslip 이동에 지연이 염색체 무기의 확산 줄일 수 있다고 지적 가치가있다.
모든 것들이 잘되면, 수많은 잘 확산 polytene 염색체가 있어야합니다. 그림 1은 두 초록색으로 interband 지역에 대한 마커와 염료로 분류, 이러한 준비의 예를 보여주는 얼룩 파란색 줄무늬 지역. 부족 확산을 얻을 경우, 염색체는 그림 2에 표시된 작은 공처럼 보이게됩니다. 반면에, 너무 많은 전이가 발생하는 경우, chomosomes 너무 얇고 확장이나 그림 3과 같이 작은 조각으로 조각난 경우에 따라 것입니다.
그림 1. Polytene 스쿼시 준비 더블 JIL - 1 히스톤 H3S10 키나제 (빨간색)와 Hoechst (파란색)에 항체으로 표시.
부족 확산과 그림 2. Polytene 스쿼시.
그림 3. 너무 확산과 Polytene 호박.
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Discussion
기존 스쿼시 고정 프로토콜의 아세트산과 젖산 지방산의 포함은 확산 interband 해상도와 염색체 팔 모두를 용이하게하지만, 불행히도 일부 epitopes이 치료를 생존하지 않습니다. 이러한 에피토프의 예는 H3S10ph입니다 (까 외., 2008). 산성 치료 또한 GFP - 태그 단백질, DiMario 외의 고유의 형광을 꺼버리는 그 단점을 가지고 있기 때문에. (2006) 최근에 산성에 민감한 epitopes의 항체 검출을위한 GFP - 항체 라벨뿐만 아니라없이 polytene 염색체에 GFP - 융합 단백질의 직접적인 시각화를 허용 포름 알데히드 기반 "산성 무료 스쿼시 기술"을 개발했습니다. 이 절차에 대한 수정은 추가 요한센 외에 자세히 설명되어 있습니다. (2009). 더블 JIL - 1 히스톤 H3S10 키나제와 Hoechst하는 항체와 레이블 대표 산성 고정 polytene 스쿼시 준비는 그림에 표시됩니다. 1.
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Acknowledgments
비행기는 주식이 작품은 건강 그랜트 (GM62916)과 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 부여 (MCB0817107)에 대한 국립 연구소에 의해 지원되었다의 유지 보수를 위해 양 V. Lephart 감사합니다.
References
- Cai, W., Bao, X., Deng, H., Jin, Y., Girton, J., Johansen, J., Johansen, K. M. RNA polymerase II-mediated transcription at active loci does not require histone H3S10 phosphorylation in Drosophila. Development. 135, 2917-2925 (2008).
- DiMario, P., Rosby, R., Cui, Z. Direct visualization of GFP-fusion proteins on polytene chromosomes. Dros. Inf. Serv. 89, 115-118 (2006).
- Johansen, K. M., Cai, W., Deng, H., Bao, X., Zhang, W., Girton, J., Johansen, J. Methods for studying transcription and epigenetic chromatin modification in Drosophila polytene chromosome squash preparations using antibodies. Methods. 48, 387-397 (2009).
