Preparação de Abóboras Drosophila cromossomos politênicos para Rotulagem de anticorpos

Summary

Este protocolo de vídeo ilustra a técnica de squash usado em laboratório para preparar Johansen

Abstract

Drosophila tem sido um modelo de sistema favorito para estudar a relação entre estrutura da cromatina e regulação de genes devido às vantagens citológicos fornecidos pela gigante cromossomos politênicos da glândula salivar de larvas de terceiro ínstar. Neste tecido dos cromossomos passar por muitos ciclos de replicação, na ausência de divisão celular dando origem a cerca de 1000 cópias. O DNA permanece alinhada após cada ciclo replicativo, resultando em cromossomos muito alargada que fornecem uma oportunidade única para correlacionar a morfologia da cromatina com a localização de proteínas específicas. Conseqüentemente, tem havido um alto nível de interesse na definição das modificações epigenéticas presente em genes diferentes e em diferentes estágios do processo de transcrição. Uma ferramenta importante para esses estudos é a rotulagem dos cromossomos politênicos com anticorpos para a enzima, fator de transcrição, ou modificação das histonas de interesse. Este protocolo de vídeo ilustra a técnica de squash usado no laboratório de Johansen para preparar cromossomos politênicos de Drosophila para a rotulagem de anticorpos.

Protocol

O seguinte protocolo para a preparação politênicos cromossomo de squash é uma adaptação do procedimento descrito no Johansen et al. (2009).

1. Cultura de larvas de terceiro instar Drosophila

A fim de obter melhor cromossomos politênicos para preparações de squash de alta qualidade, condições de cultivo uncrowded são essenciais (ou seja, coloque em torno de 20 egg-laying moscas fêmeas em um padrão de garrafa fly 4 "e mudar para um novo frasco a cada dia). Selecione o mais gordo indivíduos a partir da primeira safra de escalada larvas 3 enquanto eles ainda estão vagando, mas pouco antes de pupação. Nós cultura rotineiramente a 21 ° C 18 ° C, mas vai render mais gordos que os cromossomos podem ser mais adequados para determinados fins, como por exemplo quando a banda / interband regiões precisam ser visualizados em alta resolução.

2. Politênicos materiais de squash

• Pinça de dissecção Drummond (2)
• Placas de Petri (60 x 15 mm)
• Lâminas de microscopia fosco (n º 12-544-3 Fisher) (poli-lisina-revestido)
• 22 x 22 mm N º 15 lamínulas (Fisher No. 12-520B) (revestido com Sigmacote; Sigma # SL2)
• 22 x 40 No. 15 mm lamínulas (Fisher No. 12-530B)
• Kim-wipes
• Microscópio de contraste de fase com objetivo 20X
• Pequena Dewar (por exemplo, balão de vácuo ou garrafa térmica garrafa)
• Forceps longo
• Giletes
• Coplin Jar
• Maid de borracha ou bandeja de Tupperware (ou bandeja selável equivalente)
• Parafilme (corte em 22 quadrados mm)
• 175 pesos g

3. Fixadores e soluções

1. Estoque de formaldeído 5X. Prepare uma nova solução de 0,74 g. paraformaldeído em 4,0 ml de dH ₂ O e com 28 mL de KOH 1N. Quente a 65 ° C para dissolver o paraformaldeído e depois armazenar no gelo.
2. Fixador 1. Prepare uma nova solução de 0,5 ml de PBS 10X, 50μl Triton X-100, 3,45 ml dH ₂ O e 1,0 ml de um estoque de formaldeído 5X. Quente para dispersar o Triton X-100 e usar dentro de 1 hora.
3. Fixador 2. Prepare uma nova solução de 1,5 ml dH ₂ O, 2,5 ml de ácido acético glacial, e 1,0 ml de um estoque de formaldeído 5X e usar dentro de 1 hora.
4. Solução de ácido Lactoacetic. Prepare uma solução de 1 ml de ácido lático, 2 ml dH ₂ O, e 3 ml de ácido acético.

4. Politênicos preparação de squash cromossomo:

1. Enxágüe com água e larvas de transferência para PBS em um prato de cultura de tecidos para dissecção.
2. Segure a ponta da boca ganchos com um par de pinças, segurar o corpo cerca de 2 / 3 do caminho para baixo com o outro par, e puxar a boca ganchos para as glândulas salivares são expostas. Separe as glândulas salivares do cérebro e olho-antenais discos, e dissecar afastado a gordura corporal e quaisquer outros tecidos associados das glândulas.
3. Adicione 200 microlitros de Fixação 1 para o primeiro poço de uma lâmina de depressão duas bem e 200-300 microlitros de 2 de Fixação para o bem dois. Transferência de um par de glândulas salivares em um momento de um fixador em um bem e incubar para a quantidade de tempo necessário para o epítopo alvo, geralmente cerca de 1-2 minutos. (Nota: alguns epítopos, como para a maioria das modificações das histonas, pode exigir 5 minutos ou mais fixação.)
4. Forceps utilizando transferência de as glândulas salivares a 2 de Fixação em dois bem e incubar por dois minutos.
5. Transferência das glândulas para 10-30 ml de solução de ácido Lactoacetic em uma lamela limpa Sigmacoted. Suavemente inferior uma lâmina de microscópio polilisina revestido para a lamela e, sem aplicar pressão vertical, pegar a lamela para as glândulas são entre a lâmina ea lamela. Imediatamente facilitar a lise celular e cromossômica espalhando com cuidado segurando a lamela com uma pinça em uma extremidade e suavemente movendo-a ligeiramente para trás e para frente, tentando minimizar qualquer pressão vertical sobre o tecido. Como alternativa, use o lado da borracha de um lápis ou até mesmo um dedo para mover suavemente a lamínula e para trás. Note que qualquer atraso no movimento a lamela trás e para frente tende a diminuir se espalhando dos braços cromossômicos como eles tendem a tornar-se mais rígida em cima da exposição à solução de ácido Lactoacetic. Turvação da solução é muitas vezes uma boa indicação de separação de células. Batendo a lamela obliquamente (para evitar a pressão vertical) com o lado da borracha de um lápis, algumas vezes também pode ajudar na divulgação cromossômicas.
6. Examinar imediatamente o tecido ao microscópio de contraste de fase com um objectivo de 20 ou 40X para determinar se os cromossomos são bem distribuídos.
7. Quando o cromossômicas espalhando é suficiente, configure o slide com o lado da lamínula para baixo em uma pilha de limpeza Kim-wipes. Coloque um segundo Kim-limpe em cima e alise cromossomos, colocando o polegar sobre onde as lamelas é posicionado e pressionando firmemente, evitando qualquer movimento horizontal da lamela que cisalhamentoos cromossomos.
8. Examine o slide novamente sob o microscópio para determinar se a preparação é adequada para a finalidade pretendida. Se os cromossomos se mudaram significativamente após esmagamento, use menos volume de solução de ácido Lactoacetic em suas preparações subseqüentes. Repita os passos 4,1-4,8 até que um número suficiente de slides adequados foram obtidos. Coloque 175 g pesos sobre as lamelas das lâminas.
9. Preencher um pequeno Dewar (por exemplo, garrafa térmica) com nitrogênio líquido. Usando uma pinça longa, mergulhe em líquido deslize N ₂ até o pára ferver, retire slide, e imediatamente usar a borda de uma lâmina de barbear limpa em um canto para virar fora da lamela. Se deslize será usado imediatamente, colocar em uma jarra Coplin com PBS a 4 ° C. De outra forma coletar o slide em uma jarra Coplin cheia de etanol a 95%. Examine a lamela uma vez que a geada tenha sublimado longe para confirmar que o tecido aderido ao slide e não permanecer com a lamela. Repita com o restante dos slides até que todos os slides são armazenados em um PBS (para uso dentro de algumas horas) ou etanol (para armazenamento a longo prazo).

Resultados representante

O primeiro passo crítico para a obtenção de alta qualidade, preparação de squash politênicos é crescer larvas de gordura com núcleos das glândulas salivares grande. A segunda é uma boa técnica com o procedimento se espalhando, o que pode levar um pouco de prática. Uma dica para o sucesso espalhar melhor é encontrar o volume mínimo de solução de ácido lactoacetic durante a etapa de esmagamento. Isto irá promover a divulgação suficiente dos cromossomos sem gerar excesso de forças de fluxo que pode lavar os braços do cromossomo distância. Também é importante notar que qualquer atraso no movimento a lamela frente e para trás irá reduzir espalhando dos braços cromossômicos como eles se tornam mais rígida quando exposta à solução de ácido Lactoacetic.

Se tudo correr bem, deve haver numerosos bem distribuídos cromossomos politênicos. A Figura 1 mostra um exemplo de uma tal preparação, duplamente marcada com um marcador para regiões interband em verde e com um corante que as manchas nas regiões em faixas em azul. Se espalhando insuficiente é obtido, os cromossomos se parecerá com pequenas bolas, como mostrado na Figura 2. Por outro lado, se espalhando muito ocorreu, o chomosomes vai ser muito fino e prolongado ou em alguns casos, fragmentado em pequenos pedaços, como mostrado na Figura 3.

Figura 1. Preparação de squash politênicos duplamente marcada com o anticorpo para o JIL-1 histona H3S10 quinase (em vermelho) e Hoechst (azul).

Figura 2. Politênicos de squash com espalhando insuficiente.

Figura 3. Politênicos de squash com muita divulgação.

Discussion

A inclusão de ácido acético e láctico em protocolos convencionais de fixação de squash facilita tanto a resolução interband e braço cromossômico de propagação mas infelizmente alguns epítopos não sobrevivem este tratamento. Um exemplo de tal é um epítopo H3S10ph (Cai et al., 2008). Uma vez que o tratamento com ácido também tem a desvantagem de que sacia a fluorescência inerente de proteínas GFP, DiMario et al. (2006) desenvolveu recentemente um formaldeído-based "técnica de squash acid-free" que permitem a visualização direta do GFP-fusão de proteínas nos cromossomos politênicos sem GFP-anticorpo rotulagem, bem como para detecção de anticorpos de ácido-sensíveis epitopos. As modificações para este procedimento estão descritos em detalhes no Johansen et al. (2009). Um representante de ácido preparação de squash fixo politênicos duplamente marcada com o anticorpo para o JIL-1 histona H3S10 quinase e Hoechst é mostrado na figura. 1.