एंटीबॉडी लेबल के लिए ड्रोसोफिला Polytene क्रोमोजोम Squashes की तैयारी

Summary

यह वीडियो प्रोटोकॉल स्क्वैश Johansen प्रयोगशाला में इस्तेमाल तकनीक के लिए तैयार दिखाता है

Abstract

ड्रोसोफिला chromatin संरचना और जीन विनियमन कोशिकाविज्ञान विशाल तीसरे instar लार्वा की लार ग्रंथि polytene क्रोमोसोम द्वारा प्रदान की फायदे की वजह से के बीच संबंधों का अध्ययन करने के लिए लंबे समय से एक पसंदीदा मॉडल प्रणाली गया है. इस ऊतक में गुणसूत्रों सेल लगभग 1000 प्रतियां को जन्म देने के विभाजन के अभाव में नकल के कई दौर से गुजरना. डीएनए प्रत्येक replicative बहुत बढ़े क्रोमोसोम है कि एक अद्वितीय अवसर प्रदान करते हैं विशिष्ट प्रोटीन का स्थानीयकरण के साथ chromatin आकारिकी सहसंबंधी में जिसके परिणामस्वरूप चक्र के बाद गठबंधन बनी हुई है. नतीजतन, वहाँ विभिन्न जीनों पर epigenetic वर्तमान संशोधनों को परिभाषित करने में और प्रतिलेखन की प्रक्रिया के विभिन्न चरणों में ब्याज की एक उच्च स्तर दिया गया है. इस तरह के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण polytene क्रोमोसोम के एंजाइम को एंटीबॉडी के साथ लेबलिंग, प्रतिलेखन कारक, या ब्याज की histone संशोधन है. यह वीडियो प्रोटोकॉल स्क्वैश Johansen प्रयोगशाला में इस्तेमाल किया एंटीबॉडी लेबलिंग के लिए ड्रोसोफिला polytene क्रोमोसोम तैयार तकनीक दिखाता है.

Protocol

polytene गुणसूत्र स्क्वैश तैयारी के लिए निम्नलिखित प्रोटोकॉल Johansen एट अल में वर्णित प्रक्रिया से अनुकूलित है . (2009).

1. तीसरे instar ड्रोसोफिला लार्वा की संस्कृति

आदेश में उच्च गुणवत्ता स्क्वैश की तैयारी के लिए इष्टतम polytene गुणसूत्रों को प्राप्त करने के लिए, uncrowded संवर्धन स्थितियों के लिए आवश्यक हैं (यानी, लगभग 20 जगह अंडे बिछाने एक मानक 4 "मक्खी की बोतल और परिवर्तन में महिला मक्खियों प्रत्येक दिन एक नई बोतल के लिए) का चयन करें. Fattest व्यक्तियों 3 instar लार्वा चढ़ाई, जबकि वे अब भी भटक रहे हैं लेकिन बस pupation के लिए पहले की पहली फसल से हम 21 में नियमित संस्कृति डिग्री सेल्सियस लेकिन 18 डिग्री सेल्सियस मोटी क्रोमोसोम है कि इस तरह के रूप में कुछ प्रयोजनों के लिए उदाहरण के लिए अधिक उपयुक्त हो सकता है उपज जाएगा जब / बैंड interband क्षेत्रों के लिए उच्च संकल्प पर कल्पना करने की आवश्यकता है.

2. Polytene स्क्वैश सामग्री

• Drummond विच्छेदन संदंश (2)
• पेट्री डिश (60 x 15 मिमी)
• पाले सेओढ़ लिया माइक्रोस्कोप (फिशर सं 12-544-3) स्लाइड्स (पाली lysine लेपित)
• 22 x 22 मिमी सं 15 कवर (फिशर सं 12-520B) फिसल जाता है (Sigmacote के साथ लेपित, सिग्मा # SL2)
• 22 x 40 मिमी सं 15 कवर फिसल जाता है (फिशर सं 12-530B)
• किम पोंछे
• चरण 20X उद्देश्य के साथ इसके विपरीत खुर्दबीन
• छोटा देवर (उदाहरण के लिए, वैक्यूम फ्लास्क या थर्मस बोतल)
• लांग संदंश
• रेज़र ब्लेड
• Coplin जार
• रबड़ दासी या Tupperware ट्रे (या समकक्ष sealable ट्रे)
• Parafilm (22 मिमी वर्ग में कटौती)
• 175 ग्राम वजन

3. Fixatives और समाधान

1. 5X formaldehyde के शेयर. 0.74 जी की एक ताजा समाधान तैयार DH ₂ हे की 4.0 मिलीलीटर में और 1N KOH के 28 μl के साथ paraformaldehyde . 65 से गर्म डिग्री सेल्सियस paraformaldehyde भंग करने और फिर बर्फ की दुकान पर.
2. 1 लगानेवाला. एक 5X formaldehyde के शेयर 0.5 मिलीलीटर 10X, 50μl ट्राइटन X-100, 3.45 मिलीलीटर DH ₂ हे पीबीएस और 1.0 मिलीग्राम की एक ताजा समाधान तैयार करें. ट्राइटन X-100 फैलाने और 1 घंटे के भीतर उपयोग के लिए गर्म.
3. 2 लगानेवाला. 1.5 मिलीलीटर DH ₂ हे, 2.5 मिलीलीटर हिमनदों एसिटिक एसिड, और एक 5X formaldehyde और 1 घंटे के भीतर शेयर उपयोग से 1.0 मिलीग्राम की एक ताजा समाधान तैयार है .
4. Lactoacetic एसिड समाधान. 1 मिलीलीटर लैक्टिक एसिड, 2 मिलीलीटर DH ₂ हे, और 3 मिलीलीटर एसिटिक एसिड का एक समाधान तैयार करें.

4. Polytene गुणसूत्र स्क्वैश तैयारी:

1. पानी के साथ लार्वा कुल्ला और विच्छेदन के लिए एक ऊतक संस्कृति डिश में पीबीएस को हस्तांतरण.
2. मुट्ठी की नोक मुँह संदंश की एक जोड़ी के साथ हुक, 2 / दूसरी जोड़ी के साथ जिस तरह से नीचे के बारे में 3 शरीर पकड़, और मुँह पर पुल इतना हुक लार की गिल्टी उजागर कर रहे हैं. मस्तिष्क से लार की गिल्टी और आंख antennal डिस्क अलग है, और ग्रंथियों से दूर वसा शरीर और किसी भी अन्य संबद्ध ऊतकों टुकड़े करना.
3. एक दो अच्छी तरह से अवसाद स्लाइड की अच्छी तरह से पहले और 2 लगानेवाला के 200-300 microliters दो अच्छी तरह से एक लगानेवाला के 200 microliters जोड़ें. एक समय में एक लगानेवाला के लिए एक अच्छी तरह से लार ग्रंथियों में से एक जोड़ी और स्थानांतरण आमतौर पर 1-2 मिनट के बारे में समय की राशि लक्ष्य मिलान के लिए आवश्यक है, के लिए सेते हैं. (नोट: histone संशोधनों के अधिकांश के लिए जैसे कुछ epitopes, 5 मिनट या अब निर्धारण की आवश्यकता हो सकती है.)
4. का उपयोग संदंश अच्छी तरह से 2 में 2 लगानेवाला लार की गिल्टी और हस्तांतरण दो मिनट के लिए सेते हैं.
5. एक साफ Sigmacoted coverslip पर Lactoacetic एसिड समाधान के 10-30 μl ग्रंथियों स्थानांतरण. धीरे एक polylysine लेपित coverslip खुर्दबीन स्लाइड पर कम और ऊर्ध्वाधर दबाव लागू करने के बिना, coverslip लेने ताकि ग्रंथियों स्लाइड और coverslip के बीच हैं तुरंत ध्यान संदंश के साथ एक किनारे पर coverslip लोभी द्वारा सेल lysis और गुणसूत्र के प्रसार की सुविधा. और धीरे यह थोड़ा आगे और पीछे चलती है, ऊतक पर किसी भी ऊर्ध्वाधर दबाव को कम करने की कोशिश कर रहा. वैकल्पिक रूप से एक पेंसिल रबड़ पक्ष या यहां तक ​​कि एक fingertip का उपयोग करने के लिए धीरे coverslip कदम आगे और पीछे. ध्यान दें कि coverslip वापस और आगे बढ़ने में कोई देरी गुणसूत्र हथियारों का प्रसार कम के रूप में वे Lactoacetic एसिड समाधान के लिए जोखिम पर अधिक कठोर हो जाते हैं की संभावना है. समाधान के clouding अक्सर सेल जुदाई का एक अच्छा संकेत है. धीरे coverslip obliquely दोहन (ऊर्ध्वाधर दबाव से बचने के) एक पेंसिल रबड़ पक्ष के साथ एक बार कुछ भी गुणसूत्र के प्रसार में सहायता कर सकते हैं.
6. तुरंत एक 20 या 40x उद्देश्य के साथ एक चरण विपरीत खुर्दबीन के लिए निर्धारित करें कि क्या गुणसूत्रों अच्छी तरह से फैल रहे हैं के तहत ऊतक जांच करते हैं.
7. जब फैल गुणसूत्र पर्याप्त है, coverslip पक्ष के साथ स्लाइड नीचे सेट स्वच्छ किम - पोंछे के ढेर पर. प्लेस एक दूसरे के शीर्ष पर किम पोंछ और जहां coverslip तैनात है और मजबूती से दबाने पर अपने अंगूठे रखने coverslip कि कतरनी होगा की किसी भी क्षैतिज आंदोलन से बचने के द्वारा गुणसूत्रों समतलगुणसूत्रों.
8. जांच खुर्दबीन के नीचे फिर से स्लाइड करने के लिए निर्धारित अगर तैयारी इरादा उद्देश्य के लिए उपयुक्त है. यदि गुणसूत्रों काफी squashing पर स्थानांतरित कर दिया, अपने बाद की तैयारी में Lactoacetic एसिड समाधान की कम मात्रा का उपयोग करें. दोहराएँ 4.1-4.8 कदम जब तक उपयुक्त स्लाइड की एक पर्याप्त संख्या में प्राप्त किया गया है. स्लाइड्स के coverslip पर 175 जी वजन रखें.
9. तरल नाइट्रोजन के साथ एक छोटे देवर (उदाहरण के लिए, थर्मस बोतल) भरें. एक लंबे संदंश का _{प्रयोग,} 2 एन तरल में डुबकी स्लाइड जब तक उबलते बंद हो जाता है, स्लाइड निकालने के लिए, और तुरंत एक कोने में एक स्वच्छ धार के किनारे का उपयोग करने के लिए बंद coverslip फ्लिप. यदि स्लाइड तुरंत इस्तेमाल किया जाएगा 4 में पीबीएस के साथ एक Coplin जार में जगह डिग्री सेल्सियस वरना एक Coplin 95% इथेनॉल से भरा जार में स्लाइड एकत्र. Coverslip जांच एक बार ठंढ sublimed दूर है पुष्टि करने के लिए कि ऊतक स्लाइड का पालन और coverslip साथ रहना नहीं. स्लाइड के शेष के साथ दोहराएँ जब तक सभी स्लाइड्स या तो पीबीएस (कई घंटे के भीतर उपयोग के लिए) या इथेनॉल (लंबी अवधि के भंडारण के लिए) में संग्रहीत हैं.

प्रतिनिधि परिणाम

उच्च गुणवत्ता polytene स्क्वैश तैयारी प्राप्त करने के लिए पहला महत्वपूर्ण कदम बड़ा लार ग्रंथि नाभिक के साथ वसा लार्वा बढ़ने है. दूसरा फैल प्रक्रिया के साथ अच्छे तकनीक है, जो कुछ अभ्यास ले सकते है. सुधार प्रसार सफलता के लिए एक टिप करने के लिए squashing चरण के दौरान lactoacetic एसिड समाधान के न्यूनतम मात्रा में मिल रहा है. यह अत्यधिक स्ट्रीमिंग बलों है कि गुणसूत्र हथियारों दूर धो सकते हैं पैदा करने के बिना पर्याप्त गुणसूत्रों के प्रसार को बढ़ावा देंगे. यह भी ध्यान देने योग्य बात है कि coverslip वापस और आगे बढ़ने में कोई देरी गुणसूत्र हथियारों के प्रसार को कम करने के रूप में वे अधिक कठोर हो जाते हैं जब Lactoacetic एसिड समाधान से अवगत कराया जाएगा लायक है.

यदि सब कुछ अच्छी तरह से चला जाता है, वहाँ कई अच्छी तरह से फैल polytene गुणसूत्रों होना चाहिए. चित्रा 1 एक ऐसी तैयारी का एक उदाहरण से पता चलता है, डबल interband क्षेत्रों में हरे रंग के लिए एक मार्कर के साथ और एक डाई के साथ लेबल है कि नीले रंग में बंधी क्षेत्रों के दाग. यदि अपर्याप्त प्रसार प्राप्त है, गुणसूत्रों छोटी गेंदों, के रूप में चित्रा 2 में दिखाया गया है की तरह दिखेगा. दूसरी ओर, अगर भी फैल ज्यादा हुआ है, chomosomes भी पतली और बढ़ाया या कुछ छोटे - छोटे टुकड़ों में खंडित रूप में 3 चित्र में दिखाया गया है मामलों में किया जाएगा.

चित्रा 1. Polytene स्क्वैश तैयारी एंटीबॉडी के साथ डबल JIL - एक histone H3S10 kinase (लाल रंग में) और Hoechst (नीला) करने के लिए लेबल.

चित्रा 2. अपर्याप्त प्रसार के साथ Polytene स्क्वैश .

चित्रा 3 बहुत ज्यादा प्रसार के साथ Polytene स्क्वैश.

Discussion

पारंपरिक स्क्वैश निर्धारण प्रोटोकॉल में एसिटिक और लैक्टिक एसिड के शामिल किए जाने के दोनों interband संकल्प और गुणसूत्र हाथ फैलाने की सुविधा है, लेकिन दुर्भाग्य से कुछ epitopes इस इलाज जीवित नहीं है. इस तरह के एक मिलान का एक उदाहरण है H3S10ph (कै एट अल., 2008). चूंकि एसिड उपचार भी नुकसान है कि यह GFP टैग प्रोटीन, DiMario एट अल के निहित प्रतिदीप्ति quenches है. (2006) हाल ही में विकसित formaldehyde आधारित "स्क्वैश एसिड मुक्त तकनीक है कि" एसिड संवेदनशील epitopes के एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए GFP-एंटीबॉडी के रूप में के रूप में अच्छी तरह से लेबलिंग के बिना polytene गुणसूत्रों पर प्रोटीन GFP-संलयन के प्रत्यक्ष दृश्य के लिए अनुमति देते हैं. इस प्रक्रिया के लिए संशोधन आगे Johansen एट अल में हैं विस्तार में वर्णित है . (2009). एक प्रतिनिधि एसिड तय polytene स्क्वैश एंटीबॉडी के साथ डबल JIL - एक histone H3S10 kinase और Hoechst लेबल तैयारी छवि में दिखाया गया है. 1.