抗体標識用ショウジョウバエ多糸染色体のカボチャの準備

Summary

このビデオプロトコルは準備するヨハンセン実験室で使用されているスカッシュのテクニックを示しています。

Abstract

ショウジョウバエは、長いクロマチン構造と三齢幼虫の巨大な唾液腺多糸染色体で提供される細胞診の利点のための遺伝子調節の関係を研究するためのお気に入りのモデルのシステムとなっています。この組織では染色体は、約1000枚を生じさせる細胞分裂がない場合の複製の多くのラウンドを受ける。 DNAは、特定のタンパク質の局在化とクロマチン形態を相関させるユニークな機会を提供大幅に拡大された染色体で、その結果、各複製サイクルの後に整列されたまま。その結果、別の遺伝子で、転写プロセスの異なる段階で存在するエピジェネティックな修飾を定義することに関心の高いレベルがあった。このような研究のための重要なツールは、酵素に対する抗体を持つ多糸染色体のラベリング、転写因子、または関心のヒストン修飾です。このビデオプロトコルは、抗体の標識にショウジョウバエ多糸染色体を準備するヨハンセンの実験室で使用されているスカッシュのテクニックを示しています。

Protocol

多糸染色体のスカッシュの準備のための以下のプロトコルは、ヨハンセン氏らに記載された手順から構成されている。 （2009）。

1。三齢ショウジョウバエの幼虫の文化

高品質のスカッシュの準備に最適な多糸染色体を得るために、混雑していない培養条件は、（すなわち、20産卵標準4のメスのハエが"毎日新しいボトルにボトルや変更を飛ぶ程度の場所）が不可欠です。太った人を選択します。彼らはまださまよっている間に3齢幼虫を登るの最初の収穫からではなく、蛹化直前に我々日常的に文化で21 ° C、18 ° Cはバンドは/例えばのようないくつかの目的にはより適している可能性がありますファット染色体が得られますバンド間の領域は、高分解能で可視化する必要があります。

2。多糸スカッシュ材料

• ドラモンド郭清の鉗子（2）
• ペトリ皿（60 × 15 mm）の
• 曇らされた顕微鏡スライド（フィッシャー番号12-544-3）（ポリ-リジンコート）
• 22 × 22 mmの15号のカバースリップ（フィッシャー番号12 - 520B）（Sigmacoteでコーティングした、シグマ＃SL2）
• 22 × 40mmの15号のカバースリップ（フィッシャー番号12 - 530B）
• 金、ワイプ
• 20倍対物レンズと位相差顕微鏡
• 小さなデュワー（例えば、真空フラスコまたは魔法瓶）
• 長い鉗子
• 剃刀の刃
• コプリンジャー
• ラバーメイドやタッパーウェアトレイ（または同等の密閉式トレイ）
• パラフィルム（22 mmの正方形にカット）
• 175グラムの重み

3。固定液とソリューション

1. 5Xホルムアルデヒドの株式。 0.74 gの新鮮な溶液を調製しますのdH ₂ O 4.0 mlのと1N KOHの28μLとパラホルムアルデヒド。 65℃くらいまで温めパラホルムアルデヒドを溶解し、氷上で保存する。
2. 固定液1。 5Xホルムアルデヒドの在庫から0.5ミリリットル10 × PBS、50μlのトリトンX - 100、3.45ミリリットルのdH ₂ Oおよび1.0 mlの新鮮な溶液を調製します。トリトンX - 100を分散し、1時間以内に使用して暖かい。
3. 固定剤2。 1.5ミリリットルのdH ₂ O、2.5ミリリットル氷酢酸、および1時間以内に5倍のホルムアルデヒドの株式や使用から1.0mlの新鮮な溶液を調製します。
4. Lactoacetic酸溶液。 1ミリリットル乳酸、2ミリリットルのdH ₂ O、および3mLの酢酸溶液を調製します。

4。多糸染色体のスカッシュの準備：

1. 水で幼虫をすすぎ、解剖のための組織培養皿にPBSに移す。
2. 口の先端が鉗子一対のフック、他のペアと方法ダウンの約2 / 3体を保持つかみ、そして口を引っ張らないので唾液腺が露出しているフック。唾液、脳から腺と目触角ディスクを分離し、腺から脂肪体および他の関連する組織を離れて分析する。
3. つのよくうつ病のスライドと同様に2〜固定液2の200から300マイクロリットルの最初のウェルに固定液1の200マイクロリットルを追加。よくいずれかの固定液を1に一度唾液腺の一つのペアを転送し、通常1〜2分程度の標的エピトープに必要な時間、インキュベートする。 （注：そのようなヒストン修飾のほとんどのようないくつかのエピトープは、、5分以上固定が必要な場合があります。）
4. 使用して鉗子は、ウェル2の固定剤2に唾液腺を転送し、2分間インキュベートする。
5. クリーンSigmacotedカバースリップ上でLactoacetic酸溶液の10〜30μlに腺を転送する。静かにカバースリップ上にポリリジンでコーティングされた顕微鏡スライドを下げると、腺がスライドとカバースリップの間になるように垂直方向の圧力を適用せずに、カバースリップを拾う。 直ちに慎重に一辺上にピンセットでカバーグラスを把握し、細胞溶解と拡散染色体を容易にするゆっくりと組織上の任意の縦の圧力を最小化しようとし、少し前後に移動する。あるいは静かに前後にカバースリップを移動するにも消しゴム鉛筆の側面や指先を使う。前後にカバースリップを移動するの遅れは、彼らがLactoacetic酸溶液に曝されると、より剛性になる傾向があるので染色体腕の広がりを減少させる可能性があることに注意してください。ソリューションの混濁は、多くの場合、細胞分離の良い兆候です。ゆっくりと数回にも広がって染色体を助けることができる鉛筆の消しゴム側で（垂直方向の圧力を避けるために）斜めにカバースリップをタップします。
6. すぐに染色体が十分に広がっているかどうかを判断するために20または40倍の目標との位相差顕微鏡下で組織を調べます。
7. 拡散染色が十分であるときに、きれいな金 - ワイプのスタック上にカバースリップの側でスライドを下に設定します。せん断の場合とカバースリップのいずれかの水平移動を避け、第二の上に金がワイプとカバースリップが配置されている場所の上に親指を置き、しっかりと押すことで染色体を平坦に置きます染色体。
8. 準備が意図した目的に適しているかどうかを判断するために顕微鏡下で再びスライドを調べます。染色体が退治時に大幅に移動した場合は、あなたのその後の準備にLactoacetic酸溶液の少ない量を使用してください。適当なスライドの十分な数が得られるまで繰り返し、4.1から4.8を繰り返します。スライドのカバースリップ上175グラムのウェイトを置きます。
9. 液体窒素で小さなデュワー（例えば、魔法瓶を）埋める。長い鉗子を使用して、液体N ₂へのディップスライドは、沸騰が停止するまで、スライドを削除し、そして即座にカバースリップをオフに反転する一角で、きれいなカミソリの刃のエッジを使用してください。 4℃のPBSでコプリンジャーにスライドをすぐに使用する場合、場所℃にそうでなければ95％エタノールで満たされたコプリンジャーにスライドを収集する。霜が組織をス​​ライドに付着し、カバースリップで残っていないことを確認するために離れて昇華した後にカバースリップを調べます。すべてのスライドをPBS（数時間内で使用する）または、エタノール（長期保管用）のいずれかに格納されるまで、スライドの残りの部分で繰り返します。

代表的な結果

高品質の多糸押しつぶし標本を得るための最初の重要なステップは、大きな唾液腺の核と脂肪幼虫を成長させることです。二つ目はある程度の練習がかかる場合が拡散手続き、との良好なテクニックです。改良された拡散成功のための一つの先端は潰しステップ中lactoacetic酸溶液の最小限の量を見つけることです。これまでは染色体の腕を洗うこと、過度のストリーミング力を発生させることなく染色体の広がりを十分推進していきます。また、前後にカバースリップを動かす上でのいかなる遅延もLactoacetic酸溶液にさらされたとき、彼らはより剛性になるように染色体の腕の広がりを減少させることは注目に値する。

すべてがうまくいけば、多数のよく広がった多糸染色体があるはずです。図1は、二重緑のバンド間の領域のためのマーカーとし、色素で標識された、そのような準備の例を示している汚れ青の縞模様の地域。不十分な拡散が得られた場合、染色体は、図2に示すように、小さなボールのようになります。一方、あまり拡散が発生した場合、chomosomesは薄すぎると、拡張または図3に示すように、細かく断片化いくつかのケースになります。

ダブルJIL - 1ヒストンH3S10キナーゼ（赤）とヘキスト（青色）に対する抗体で標識図1。多糸スカッシュの準備。

不十分な拡散と図2。多糸スカッシュ。

図3。すぎる広がりを持つ多糸スカッシュ。

Discussion

従来のスカッシュ固定プロトコルの酢酸と乳酸を含めることは、拡散バンド間分解能と染色体腕の両方を促進するが、残念ながら、いくつかのエピトープは、この治療を生きていけない。そのようなエピトープの例は、H3S10ph（カイら 、2008）である。酸処理はまた、GFPタグ融合タンパク質、DiMario らの固有の蛍光を消光するという欠点を持っているので。 （2006）最近、GFP -抗体標識なしと同様に酸感受性エピトープの抗体検出のための多糸染色体上にGFP -融合タンパク質の直接可視化を可能にするホルムアルデヒドベースの"酸無スカッシュの技術"を開発。この手順の変更は、さらにヨハンセンらに詳細に記載されている。 （2009）。代表的な酸は二重抗体で標識された多糸押しつぶし標本を固定するためにJIL - 1ヒストンH3S10キナーゼ及びヘキストは、図に示されています。 1。