Beredning av Drosophila polytene Kromosom Squash för Antibody Labeling

Summary

Denna video protokoll illustrerar squash teknik som används i Johansen laboratoriet att förbereda

Abstract

Drosophila har länge varit en favorit modellsystem för att studera sambandet mellan kromatinstrukturen och genreglering på grund av den cytologiska fördelar som den jättelika saliv kromosomer körtel polytene tredje INSTAR larver. I denna vävnad kromosomerna genomgår många rundor av replikering i avsaknad av celldelning som ger upphov till cirka 1000 exemplar. De DNA kvar anpassat efter varje replikationsförmåga cykel resulterar i kraftigt förstorad kromosomer som ger en unik möjlighet att korrelera kromatin morfologi med lokalisering av specifika proteiner. Därför har det funnits en hög nivå av intresse i fastställandet av epigenetiska modifieringar närvarande vid olika gener i olika skeden av transkriptionen. Ett viktigt verktyg för sådana studier är märkning av polytene kromosomer med antikroppar mot enzymet, transkriptionsfaktor, eller histon ändring av intresse. Denna video protokoll illustrerar squash teknik som används i Johansen laboratoriet att förbereda Drosophila polytene kromosomer för antikroppar märkning.

Protocol

Följande protokoll för polytene kromosom squash förberedelse är anpassad från det förfarande som beskrivs i Johansen et al. (2009).

1. Kultur för tredje INSTAR Drosophila larver

För att få optimal polytene kromosomer för hög förberedelser kvalitet squash, uncrowded odling villkor är viktiga (dvs plats runt 20 äggläggande hona flugor i en standard 4 "flyga flaska och byta till en ny flaska varje dag). Välj den fetaste individer från den första skörden av klättring 3:e INSTAR larver medan de fortfarande vandra, men strax före pupation. Vi kultur rutinmässigt vid 21 ° C men 18 ° C kommer att ge fetare kromosomer som kan vara mer lämplig för vissa ändamål som till exempel då band / interband regioner måste visualiseras med hög upplösning.

2. Polytene squash material

• Drummond dissektion pincett (2)
• Petriskålar (60 x 15 mm)
• Frostad objektglas (Fisher nr 12-544-3) (poly-lysin-belagda)
• 22 x 22 mm Nr 15 täckglas (Fisher nr 12-520B) (belagda med Sigmacote, Sigma # SL2)
• 22 x 40 mm Nr 15 täckglas (Fisher nr 12-530B)
• Kim-våtservetter
• Faskontrastmikroskop med 20x objektiv
• Små Dewar (t.ex. termos eller termos)
• Lång pincett
• Rakblad
• Coplin Jar
• Gummi-Maid eller Tupperware fack (eller motsvarande förseglingsbar fack)
• Parafilm (skuren i 22 mm rutor)
• 175 g vikter

3. Fixeringsmedel och lösningar

1. 5X formaldehyd lager. Bered en färsk lösning av 0,74 g. paraformaldehyd i 4,0 ml dH ₂ O och med 28 ìl 1N KOH. Värmas upp till 65 ° C för att upplösa paraformaldehyd och sedan lagra på is.
2. Fixative 1. Bered en färsk lösning av 0,5 ml 10X PBS, 50μl Triton X-100, 3,45 ml dH ₂ O och 1,0 ml från en 5X formaldehyd lager. Varm för att skingra Triton X-100 och använd inom 1 timme.
3. Fixative 2. Bered en färsk lösning av 1,5 ml dH ₂ O, 2,5 ml isättika och 1,0 ml från en 5X formaldehyd lager och använd inom 1 timme.
4. Lactoacetic sur lösning. Bered en lösning av 1 ml mjölksyra, 2 ml dH ₂ O, och 3 ml ättiksyra.

4. Polytene kromosom squash förberedelser:

1. Skölj larver med vatten och överföring till PBS i en vävnadsodling maträtt för dissekering.
2. Ta tag i spetsen på munnen krokar med en pincett, hålla kroppen ca 2 / 3 av vägen ner med det andra paret, och dra på munnen krokarna så spottkörtlarna är utsatta för. Separera spottkörtlar från hjärnan och ögon-antennal skivor och dissekera bort kroppsfett och andra tillhörande vävnader från körtlar.
3. Tillsätt 200 mikroliter av Fixative 1 till den första brunnen i en två väl depression bild och 200-300 mikroliter av Fixative 2 väl två. Överföring ett par av spottkörtlarna i taget för att Fixative 1 i väl en och inkubera i den tid som krävs för epitop, vanligtvis cirka 1-2 minuter. (Obs: vissa epitoper, som för de flesta histon ändringar kan kräva 5 minuter eller längre fixering.)
4. Använd pincett överföra spottkörtlarna att Fixative 2 i väl 2 och inkubera i två minuter.
5. Överför körtlar till 10-30 ìl Lactoacetic sur lösning på en ren Sigmacoted täckglas. Lägg försiktigt ner en polylysine-belagda objektglas på täckglas och, utan att vertikala tryck, plocka upp täckglas så att körtlarna är mellan bild och täckglas. Omedelbart underlätta cellslys och kromosomala sprids genom att noggrant ta tag i täckglas med pincett i ena kanten och försiktigt flytta den lite fram och tillbaka, försöker att minimera eventuella vertikala trycket på vävnaden. Alternativt använda radergummit sidan av en penna eller ett finger för att försiktigt flytta täckglas fram och tillbaka. Observera att varje försening i att flytta täckglas och tillbaka är sannolikt att minska spridningen av kromosomala armarna eftersom de tenderar att bli mer rigida vid exponering för Lactoacetic sur lösning. Grumling av lösningen är ofta en bra indikation på cellseparation. Knacka försiktigt på täckglas snett (för att undvika vertikala tryck) med radergummit sidan av en penna några gånger även hjälpa till med kromosomala spridning.
6. Omgående undersöka vävnaden i faskontrastmikroskop med 20 eller 40X objektiv för att avgöra om kromosomerna är väl spritt.
7. När kromosomal spridning är tillräckliga, ställ in bilden med täckglas sidan nedåt på en hög med ren Kim-våtservetter. Placera en andra Kim-torka ovanpå och platta kromosomer genom att placera tummen över var täckglas är placerad och trycka på ordentligt, undvika horisontell rörelse täckglas som skulle skjuvningkromosomerna.
8. Undersök bilden igen under mikroskop för att avgöra om preparatet är lämpligt för det avsedda ändamålet. Om kromosomer har flyttat avsevärt vid krossa, använda mindre mängd Lactoacetic sur lösning i ditt kommande förberedelser. Upprepa steg 4,1-4,8 tills ett tillräckligt antal lämpliga bilder har erhållits. Placera 175 g vikter på täckglas av bilderna.
9. Fyll en liten Dewar (t.ex. termos) med flytande kväve. Med hjälp av en lång pincett, doppa glida till flytande N ₂ tills den kokande stopp, ta bort bilden, och omedelbart använda kanten av ett rent rakblad i ena hörnet för att vända bort täckglas. Om bilden ska användas omedelbart och placera i en Coplin burk med PBS vid 4 ° C. Annat sätt samla in bilden i ett Coplin burk fylld med 95% etanol. Undersök täckglas när frosten har sublimerat bort att bekräfta att vävnaden anslutit sig till bilden och inte vara med täckglas. Upprepa med resten av bilderna tills alla bilder lagras i antingen PBS (för användning inom flera timmar) eller etanol (under en längre tid).

Representativa resultat

Det första kritiska steget för att få hög kvalitet förberedelse polytene squash är att växa feta larver med stora spottkörteln kärnor. Den andra är bra teknik med spridning förfarande, vilket kan ta lite övning. Ett tips för bättre spridning framgång är att hitta den minimala volymen lactoacetic sur lösning under klämma steg. Detta kommer att främja tillräcklig spridning av kromosomer utan att generera stora strömmande krafter som kan tvätta kromosom armar bort. Det är också värt att notera att varje försening i att flytta täckglas och tillbaka kommer att minska spridning av kromosomala armarna när de blir mer rigida när de utsätts för Lactoacetic sur lösning.

Om allt går bra bör det finnas många väl spridda polytene kromosomer. Figur 1 visar ett exempel på en sådan beredning, dubbel märkt med en markör för interband regioner i grönt och med ett färgämne som färgar banded regionerna i blått. Om otillräcklig spridning erhålls, kommer kromosomerna ser ut som små bollar, som visas i figur 2. Å andra sidan, om för mycket spridning har skett kommer chomosomes vara för tunn och förlängas eller i vissa fall uppdelad i små bitar som visas i Figur 3.

Figur 1. Polytene squash förberedelse märkt dubbel med antikropp mot JIL-1 histon H3S10 kinas (i rött) och Hoechst (blå).

Figur 2. Polytene squash med otillräcklig spridning.

Figur 3. Polytene squash med för mycket spridning.

Discussion

Införandet av ättiksyra och mjölksyra i konventionella protokoll squash fixering underlättar både interband upplösning och kromosomala armen sprids men tyvärr vissa epitoper inte överlever denna behandling. Ett exempel på en sådan epitop är H3S10ph (CAI et al., 2008). Sedan syrabehandling har också nackdelen att det släcker inneboende fluorescens GFP taggade-proteiner, DiMario et al. (2006) nyligen utvecklat en formaldehydbaserade "syrafritt squash teknik" som möjliggör direkt visualisering av GFP-fusionsprotein på polytene kromosomerna utan GFP-antikroppar märkning samt för påvisande av antikroppar av syra-känsliga epitoper. Ändringarna för detta förfarande beskrivs närmare i detalj i Johansen et al. (2009). En representant syra fast polytene squash förberedelse dubbel märkta med antikroppen mot JIL-1 histon H3S10 kinas och Hoechst visas i figur. 1.