Vorbereitung von Drosophila Polytäne Chromosome Kürbisse für Antikörpermarkierung

Summary

Dieses Video-Protokoll zeigt die Squash-Technik in der Johansen-Labor dient zur Vorbereitung

Abstract

Drosophila ist seit langem ein beliebtes Modellsystem für die Erforschung der Beziehung zwischen Chromatinstruktur und Genregulation durch die zytologische Vorteile durch die riesigen Speicheldrüse Polytänchromosomen des dritten Larvenstadium zur Verfügung gestellt worden. In diesem Gewebe die Chromosomen durchlaufen viele Runden der Replikation in Abwesenheit der Zellteilung, die zu etwa 1000 Exemplaren. Die DNA ausgerichtet bleibt nach jedem replikativen Zyklus resultierende stark vergrößert Chromosomen, die eine einzigartige Gelegenheit, Chromatin Morphologie mit der Lokalisierung von spezifischen Proteinen korreliert sind. Folglich hat es ein hohes Maß an Interesse an der Festlegung der epigenetischen Modifikationen derzeit an verschiedenen Genen und in den verschiedenen Phasen der Transkription Prozess. Ein wichtiges Instrument für solche Untersuchungen ist die Kennzeichnung von Polytänchromosomen mit Antikörpern gegen das Enzym, Transkriptionsfaktor, oder Histon-Modifikation von Interesse. Dieses Video-Protokoll zeigt die Squash-Technik in der Johansen Labor verwendet werden, um Drosophila Polytänchromosomen für Antikörpermarkierung vorzubereiten.

Protocol

Das folgende Protokoll für Polyäthylen-Chromosom Squash Vorbereitung ist von dem Verfahren in Johansen et al angepasst. (2009).

1. Kultur des dritten Stadiums Drosophila-Larven

Um eine optimale Polytänchromosomen für hochwertige Squash-Präparate zu erhalten, sind nicht überfüllt Kultivierungsbedingungen wesentlichen (dh, statt rund 20 eierlegenden Weibchen fliegt in einem Standard-4 "fliegen Flaschen und wechseln Sie in eine neue Flasche pro Tag). Wählen Sie die dicksten Menschen aus dem ersten Jahrgang des Kletterns dritten Larvenstadium, während sie noch wandern, aber kurz vor der Verpuppung. Wir routinemäßig Kultur bei 21 ° C aber 18 ° C erbringt fetter Chromosomen, die besser geeignet für bestimmte Zwecke, wie zum Beispiel kann, wenn band / Interband Regionen müssen in hoher Auflösung dargestellt werden.

2. Polytäne Squash Materialien

• Drummond Dissektionszangen (2)
• Petrischalen (60 x 15 mm)
• Frosted Objektträger (Fisher Nr. 12-544-3) (poly-Lysin-beschichtete)
• 22 x 22 mm Nr. 15 Deckgläser (Fisher Nr. 12-520B) (beschichtet mit Sigmacote; Sigma # SL2)
• 22 x 40 mm Nr. 15 Deckgläser (Fisher Nr. 12-530B)
• Kim-Tücher
• Phasenkontrast-Mikroskop mit 20x-Objektiv
• Kleine Dewar (zB Thermoskanne oder Thermosflasche)
• Lange Pinzette
• Rasierklingen
• Coplin Jar
• Gummi-Maid oder Tupperware-Fach (oder äquivalente verschließbaren Fach)
• Parafilm (Schnitt in 22 mm Quadrate)
• 175 g Gewicht

3. Fixative und Lösungen

1. 5X Formaldehyd Lager. Bereiten Sie eine frische Lösung von 0,74 g. Paraformaldehyd in 4,0 ml dH ₂ O und mit 28 ul 1N KOH. Warm bis 65 ° C, um die Paraformaldehyd zu lösen und dann auf Eis lagern.
2. Fixativ 1. Bereiten Sie eine frische Lösung von 0,5 ml 10X PBS, 50 ul Triton X-100, 3,45 ml dH ₂ O und 1,0 ml von einem 5fach-Formaldehyd-Lager. Warm, die Triton X-100 verteilen und innerhalb von 1 Stunde.
3. Fixativ 2. Bereiten Sie eine frische Lösung von 1,5 ml dH ₂ O, 2,5 ml Eisessig und 1,0 ml von einem 5fach-Formaldehyd-Lager und innerhalb von 1 Stunde.
4. Lactoacetic saurer Lösung. Bereiten Sie eine Lösung aus 1 ml Milchsäure, 2 ml dH ₂ O und 3 ml Essigsäure.

4. Polytäne Chromosom Squash Zubereitung:

1. Spülen Larven mit Wasser und Transfer zum PBS in einem Gewebe Kulturschale für die Präparation.
2. Fassen Sie die Spitze des Mundhaken mit einer Pinzette, halten den Körper zu 2 / 3 des Weges nach unten mit dem anderen Paar, und ziehen auf den Mund Haken, so dass die Speicheldrüsen ausgesetzt sind. Trennen Sie die Speicheldrüsen aus dem Gehirn und Auge-Fühlerglied Discs und sezieren das Fett Körper und alle anderen damit verbundenen Gewebe aus den Drüsen.
3. Add 200 Mikroliter Fixativ 1 mit dem ersten und einer zwei gut Depression schieben und 200-300 Mikroliter Fixativ 2 bis gut zwei. Transfer ein Paar Speicheldrüsen zu einer Zeit, zu Fixativ 1 in gut ein und inkubieren für die Menge an Zeit für die Ziel-Epitop erforderlich, in der Regel ca. 1-2 Minuten. (Hinweis: Einige Epitope, wie für die meisten der Histon-Modifikationen, kann 5 Minuten oder länger Fixierung erforderlich ist.)
4. Mit einer Pinzette Übertragung der Speicheldrüsen zu Fixativ 2 in gut 2 und inkubieren für zwei Minuten.
5. Übertragen Sie die Drüsen auf 10-30 ul Lactoacetic saurer Lösung auf eine saubere Sigmacoted Deckglas. Senken Sie einen Polylysin-beschichteten Objektträger auf das Deckglas und ohne Anwendung vertikaler Druck, nehmen Sie den Deckglas so die Drüsen zwischen dem Schieber und dem Deckglas werden. Sofort erleichtern Zelllyse und chromosomalen Ausbreitung durch vorsichtiges Greifen des Deckglas mit einer Pinzette an einer Kante und sanft bewegt es leicht hin und her und versucht, alle vertikalen Druck auf das Gewebe zu minimieren. Alternativ können Sie den Radiergummi Seite eines Bleistifts oder sogar eine Fingerspitze sanft bewegen das Deckglas hin und her. Beachten Sie, dass jede Verzögerung bei der Bewegung des Deckglas hin und her wahrscheinlich verschwinden Verbreitung der chromosomalen Arme, als sie dazu neigen wird, um sehr viel strenger bei der Belichtung mit der Lactoacetic saure Lösung. Trübung der Lösung ist oft ein guter Indikator für die Zellseparation. Leichtes Antippen des Deckglases schräg (zum vertikalen Druck zu vermeiden) mit dem Radiergummi Seite eines Bleistifts ein paar Mal kann auch helfen, in chromosomale verbreiten.
6. Unmittelbar untersuchen das Gewebe unter einem Phasenkontrast-Mikroskop mit einer 20 oder 40X-Objektiv, um festzustellen, ob die Chromosomen gut verteilt sind.
7. Wenn der chromosomalen Ausbreitung ausreichend ist, stellen Sie die Folie mit dem Deckglas nach unten auf einen Stapel von sauberen Kim-wischt. Legen Sie einen zweiten auf Kim-Wisch-und platt-Chromosomen, indem Sie Ihren Daumen über dem Deckglas positioniert ist und die Taste fest und vermeiden Sie jede horizontale Bewegung des Deckglases das würde Scherungder Chromosomen.
8. Untersuchen Sie die Folie wieder unter dem Mikroskop zu bestimmen, ob das Präparat eignet sich für den vorgesehenen Zweck. Wenn Chromosomen deutlich auf Quetschen verschoben haben, verbrauchen weniger Volumen von Lactoacetic-Lösung in Ihrem anschließenden Vorbereitungen. Wiederholen Sie die Schritte 4,1-4,8, bis eine ausreichende Anzahl von geeigneten Folien erhalten worden sind. Legen Sie 175 g Gewichte auf das Deckglas des Dias.
9. Füllen Sie einen kleinen Dewar (zB Thermoskanne) mit flüssigem Stickstoff. Mit einer langen Zange, dip Abgleiten in flüssigem N _2, bis das Kochen aufhört, entfernen Sie schieben und sofort nutzen Rande einer sauberen Rasierklinge an einer Ecke zu drehen, das Deckglas. Ist der Verschluss sofort verwendet werden soll, in einem Coplin Glas mit PBS bei 4 ° C. Ansonsten sammeln die Folie in eine Coplin-Gefäß mit 95% igem Ethanol gefüllt. Untersuchen Sie das Deckglas, sobald der Frost weg, um zu bestätigen, dass das Gewebe um die Folie aufgeklebt und nicht mit dem Deckglas bleiben sublimiert. Wiederholen Sie mit dem Rest der Folien bis alle Objektträger entweder in PBS (für den Einsatz innerhalb von wenigen Stunden) oder Ethanol (für längere Lagerung) gespeichert werden.

Repräsentative Ergebnisse

Der erste wichtige Schritt für den Erhalt von qualitativ hochwertigen polytänen Squash Vorbereitung ist, um Fett Larven mit großen Speicheldrüse Kerne wachsen. Die zweite ist eine gute Technik mit der Verbreitung Verfahren, das etwas Übung können. Ein Tipp für bessere Verbreitung Erfolges ist, den minimalen Volumen von lactoacetic saurer Lösung während der Quetschung Schritt zu finden. Dies fördert ausreichender Spreizung der Chromosomen, ohne dass übermäßige Streaming Kräfte, die Chromosom Arme reinigen können weg. Es ist auch erwähnenswert, dass jede Verzögerung bei der Bewegung des Deckglas hin und her verringert die Verbreitung der chromosomalen Arme, als sie eine höhere Steifigkeit werden, wenn die Lactoacetic saurer Lösung ausgesetzt.

Wenn alles gut geht, sollte es zahlreiche gut verteilt Polytänchromosomen werden. Abbildung 1 zeigt ein Beispiel für eine solche Vorbereitung, Doppelzimmer mit einem Marker für Interband Regionen in grün und mit einem Farbstoff markiert, die Flecken der gebänderten Regionen in blau. Wenn nicht genügend verbreitet ist erhalten, werden die Chromosomen wie kleine Kugeln, wie in Abbildung 2 dargestellt aussehen. Auf der anderen Seite, wenn zu viel verbreitet aufgetreten ist, wird die chomosomes zu dünn und verlängert oder in einigen Fällen in kleine Stücke zersplittert wie in Abbildung 3 dargestellt.

Abbildung 1. Polytäne Squash Vorbereitung Doppelzimmer mit Antikörpern gegen die JIL-1 Histon H3S10-Kinase (in rot) und Hoechst (blau) markiert.

Abbildung 2. Polytäne Squash mit unzureichender Verbreitung.

Abbildung 3. Polytäne Squash mit zu viel verbreitet.

Discussion

Die Aufnahme von Essig-und Milchsäure in konventionellen Squash Fixierung Protokolle erleichtert sowohl Interband Auflösung und chromosomalen Arm ausbreitet, aber leider auch einige Epitope nicht überleben diese Behandlung. Ein Beispiel für solch ein Epitop ist H3S10ph (Cai et al., 2008). Da Säurebehandlung hat auch den Nachteil, dass sie die Eigenfluoreszenz von GFP-markierten Proteine, DiMario et al stillt. (2006) kürzlich eine Formaldehyd-based "säurefrei Squash-Technik", die für die direkte Visualisierung von GFP-Fusionsprotein auf Polytänchromosomen ermöglichen, ohne GFP-Antikörper-Kennzeichnung sowie für die Antikörper-Nachweis von Säure-sensitive Epitope. Die Änderungen für dieses Verfahren sind weiter im Detail in Johansen et al. (2009). Ein Vertreter Säure feste polytänen Squash Vorbereitung Doppelzimmer mit Antikörpern gegen die JIL-1 Histon H3S10-Kinase und Hoechst beschriftet ist in Abb.. 1.