Um dispositivo micro para Quantificar Quimiotaxia bacteriana em gradientes de concentração estável

Summary

Este protocolo descreve o desenvolvimento de um dispositivo micro para investigar quimiotaxia bacteriana em gradientes de concentração estável de chemoeffectors.

Abstract

Quimiotaxia permite que as bactérias abordagem fontes de produtos químicos ou atrativo para evitar fontes de produtos químicos repelentes. Bactérias monitorar constantemente a concentração de chemoeffectors específicas, comparando a concentração atual para a concentração detectados alguns segundos antes. Esta comparação determina a direção líquido de movimento. Embora múltiplos, gradientes concorrentes freqüentemente coexistem na natureza, abordagens convencionais para investigar quimiotaxia bacteriana são de qualidade inferior para a quantificação da migração em resposta a gradientes de concentração de atrativos e repelentes. Aqui, descrevemos o desenvolvimento de um modelo de quimiotaxia microfluídicos para a apresentação de gradientes de concentração precisa e estável de chemoeffectors a bactérias e quantitativamente a investigar sua resposta ao gradiente aplicado. O dispositivo é versátil na medida em que gradientes de concentração de qualquer concentração desejada absoluta e força de gradiente pode ser facilmente gerado pela mistura difusivo. O dispositivo é demonstrada usando a resposta de

Protocol

1. Fabricação de mestres de silício usando fotolitografia SU-8 padrão ¹ (não é mostrado neste vídeo).

1. Uso padrão SU-8 métodos de fotolitografia para criar um SU-8 "master" (SU-8 2025, Microchem, Newton, MA) para a fabricação do molde PDMS que contém a rede microfluídicos e câmara de quimiotaxia. Moldes como mestre pode ser fabricado em qualquer instalação de microfabricação (por exemplo, Stanford microfluídica Fundição; http://thebigone.stanford.edu/foundry/ ).
2. Antes da replicação do PDMS, exponha o SU-8 master vapor fluorosilane em um dessecador conectado a uma fonte de vácuo para facilitar a liberação fácil de PDMS do mestre. Adicionar uma gota de fluorosilane para uma toalha de papel e aplicar vácuo para uma min. Remova a vácuo e aguarde 30 min para a deposição de fluorosilane. Mantenha o mestre SU-8 em um recipiente fechado para uso futuro.

2. Moldagem réplica de PDMS de SU-8 master: A camada fluídica ea camada de controle são feitos por moldagem réplica de PDMS de SU-8 master.

1. Misture o PDMS pré-polímero e cross-linker em um wt 10:01. relação e desgaseificar em um dessecador por 1 hora (ou até que as bolhas de ar são removidos da mistura de PDMS).
2. Coloque o mestre-8 SU numa placa de Petri e cuidadosamente despeje a mistura PDMS em cima do mestre SU-8 com a espessura desejada.
3. Aqueça a placa de petri contendo o PDMS eo SU-8 molde mestre em 80 ° C por duas horas para curar o PDMS.
4. Remover o curado PDMS coberto SU-8 mestre da placa e casca do molde PDMS do SU-8 master. A estrutura desejada será incorporado no molde PDMS.
5. Faça furos no molde PDMS para tubulação para o gerador de gradiente e de entrada de células usando uma agulha de calibre 20 blunt-end.

3. Colagem de PDMS dispositivos:

1. Limpe uma lâmina de vidro com isopropanol e seco com nitrogênio ou um fluxo de ar.
2. Expor o PDMS e vidro deslizante para plasma de oxigênio em um asher plasma.
3. Traga o molde PDMS em contato com a lâmina de vidro. Aqueça o slide contactado e mofo PDMS a 65 ° C por 15 min.

4. A montagem do dispositivo de PDMS

1. Usando uma lâmina de barbear, cortar tubos em um ângulo de 45 ° para o comprimento correto necessário para o dispositivo.
2. Insira uma extremidade do tubo nos orifícios perfurados no dispositivo (por exemplo, saída) usando uma pinça.
3. Utilizando uma pinça, insira uma agulha de calibre 30 sem corte na outra extremidade do tubo.
4. Repita o passo 4.2 para todos os buracos restantes.
5. Coletar 1 ml de quimiotaxia buffer (CB) em uma seringa de 3ml, tendo o cuidado de remover bolhas de ar da seringa.
6. Fixar um hub agulha para uma extremidade da tubulação de saída.
7. Adicionar CB ao hub agulha, e toque no hub agulha para remover quaisquer bolhas de ar.
8. Empurrar um pouco para fora CB da ponta da seringa e conecte a seringa 3mL ao hub agulha sem aprisionamento de ar.
9. Empurre CB através do dispositivo até que todos os hubs agulha restantes são preenchidos com a CB. Isso deve remover a maioria das bolhas de ar.
10. Preencher duas seringas com 500μL CB contendo as concentrações adequadas dos chemoeffector sendo testado. Eliminar a formação de bolhas de ar empurrando uma pequena gota do conteúdo da seringa e tocar a gota do líquido no hub agulha e anexando.
11. Da mesma forma, conectar uma seringa contendo CB para a entrada de bactérias. Este será removida quando as bactérias são introduzidas no dispositivo.

5. Crescimento de E. altamente móveis coli

1. Crescer durante a noite culturas de E. coli RP437 com uma expressão de GFP plasmídeo em 20 mL de caldo de triptona (TB) em 32 ° C com agitação. Adicionar concentrações adequadas de antibiótico para manter o plasmídeo. Em nosso protocolo, usamos um pCM182 baixa cópia do plasmídeo para a detecção de bactérias com base na fluorescência no dispositivo. Para E. coli, as culturas a crescer a 32 ° C é recomendado para alta motilidade, sendo a mobilidade é menor em temperaturas mais altas.
2. Use a cultura durante a noite para inocular uma cultura de 20 mL de TB em um erlenmeyer de 250 mL de densidade óptica, a 600nm de ~ 0,05. Crescer a cultura com agitação a 32 ° C.
3. Colher as células em uma OD de ₆₀₀ ~ 0,35 0,45 pela baixa velocidade de centrifugação a 400 xg por 5 min.
4. Ressuspender as células a uma OD de ₆₀₀ ~ 0,35 em CB contendo o chemoeffector na concentração esperada no meio do canal.
5. Adicionar RFP marcado células mortas em uma OD de ₆₀₀ ~ 0,35 para as células expressando GFP-viver. Os mortos (vermelho), as células são usados ​​como um controle interno para assegurar que qualquer migração não é devido aos efeitos de fluxo.

6. Quimiotaxia de monitoramento

1. Remover alguns dos CB da agulha de entrada celularhub. Refil com a suspensão de células.
2. Preencha cuidadosamente a seringa 50μL com as células ressuspenso. Esta etapa deve ser feito lentamente como flagelos pode ser cortado e vai reduzir a motilidade.
3. Conecte a seringa 50μL para o hub de entrada agulha conforme descrito nas etapas passo 4.10.
4. A posição do dispositivo no palco de um microscópio de fluorescência equipado com uma câmera de alta velocidade para aquisição de imagem. Coloque as seringas de entrada (tanto os 500 seringas gradiente mL e 50 mL seringa de células) na bomba de seringa e iniciar o fluxo de tal forma que o gradiente é formado e células estão fluindo através do tubo.
5. Uma vez que as células entram na câmara de quimiotaxia, espere ~ 20 min para o sistema se estabilize antes de imagem.
6. Colete verde (ao vivo) e vermelho (mortos) imagens de fluorescência em diferentes locais ao longo do comprimento da câmara (correspondentes a diferentes tempos de exposição). Normalmente, coletamos 100 imagens de cada local em intervalos de 3 segundos.

7. Análise de dados: Os seguintes passos podem ser realizadas usando qualquer programa de análise de imagem disponível no mercado (por exemplo, ImageJ, Metamorph) ou usando códigos simples escrito em Matlab.

1. Remover os pixels na imagem de fundo (ou seja, regular a intensidade do pixel limiar e remover todos os pixels que têm intensidade menor do que o limiar). Este ruído minimiza na análise.
2. Use a posição das células mortas (fluorescência vermelha) para determinar o centro da imagem. Uma vez que as células mortas não mostram quimiotaxia, esta representa a posição onde as células entraram na câmara de quimiotaxia e seria detectada na ausência de qualquer migração.
3. Localizar células vivas (fluorescência verde) na imagem.
4. Divide a imagem em canais e determinar o número de células vivas em cada canal. Em nosso trabalho anterior ^3, a 1050 m de largura quimiotaxia câmara foi dividida em 64 canais que são cada ~ 16 m de largura.
5. Repita os passos 7,1 7,3 para todas as imagens e soma a contagem celular total para cada canal em todas as imagens. Isto dá a contagem de células total detectado em cada canal ao longo da duração do experimento.
6. Calcular o coeficiente de partição quimiotaxia (CPC), que representa a direção da migração, da seguinte forma: Cada célula localizada na alta concentração (direita) e baixa concentração (à esquerda) os lados das células mortas é atribuído um multiplicador de +1 e -1 , respectivamente. Isto é, uma célula que migra de um gradiente é multiplicado por um, enquanto as células se movendo para baixo o gradiente são multiplicados por -1. Todos os valores multiplicados são somados e normalizados para o número total de células detectadas. Por exemplo, um valor de CPC de 0,40 indica que 40% a mais do total de bactérias mudou-se para o lado concentração elevada do que o lado de baixa concentração (ou seja, o chemoeffector é um atrativo a mais bactérias foram detectadas movendo-se o gradiente).
7. Calcular o coeficiente de migração quimiotaxia (CMC), que pesa a migração de células, a distância percorrida, como segue: contagem de Peso da célula em cada canal por um fator que é proporcional à distância que as células migram. Uma célula que se move para a posição mais distante de alta concentração (canal 64) é dado um factor de ponderação de 1, enquanto que aquele que se move na metade do lado maior concentração é dado um factor de ponderação de 0,5, e uma célula de se mudar para o mais distante baixa concentração de posição é ponderada por -1. Soma-se todas as contagens de células ponderada e normalizar o número de células para gerar o CMC.

Resultados representante ^3,4:

Temos utilizado o dispositivo micro (Figura 1A) descrito aqui para investigar quimiotaxia de E. coli em gradientes de atrativos (ácido aspártico, autoinducer-2) e repelentes (NISO _4, indole) ^3,4. O protótipo tensão quimiotaxia ⁵ E. coli expressando GFP RP437 foi utilizado, juntamente com canamicina-morto E. coli TG1 células expressando a proteína fluorescente vermelha para monitorar os efeitos de fluxo. O gradiente de concentração formado no dispositivo μFlow é mostrado na Figura 1B. A entrada de celulares foi tampado para que não havia fluxo através dele e um gradiente estável de 0 a 100 ng / mL de fluoresscein foi estabelecido no dispositivo. A intensidade dos pixels através do dispositivo foi utilizado para determinar o perfil de concentração de fluoresceína. Os dados mostram que as bactérias encontram um gradiente linear quando entram na câmara de quimiotaxia. Figura 2A e B mostra imagens de fluorescência de E. migrando RP437 coli em resposta a gradientes de ácido aspártico (0 100 mM) e Niso ₄ (0 225 mM). As respostas observadas para essas attractant canônica e repelente são como previsto. Figura 3A mostra a distribuição quantificada da E. coli RP437 na ausência de um gradiente de concentração (ou seja, gradiente nulo de ácido aspártico), enquantoFiguras 3B e C mostram a distribuição em gradientes de ácido aspártico ea NISO _4. A especificidade dessas respostas (ou seja, o viés da migração) é evidente como E. RP437 coli Δ tar tensão (ie, sem a tensão quimiorreceptora Tar que é usado em E. coli para detectar o ácido aspártico e níquel) não demonstra a tendência da migração na presença de um gradiente de concentração de ácido aspártico ou NISO _4. As tendências evidentes nos perfis de distribuição espacial também são consistentes com os valores calculados e CPC CMC. Os valores de CPC para a migração de E. coli RP437 em gradientes de ácido aspártico ou NISO ₄ são 0,33 e -0,33, respectivamente. Os valores correspondentes CMC são 0,13 e -0,14, respectivamente. Em contraste, o CPC ea CMC valores com o E. coli RP437 Δ tensão tar em gradientes de ácido aspártico ou NISO ₄ são desprezíveis. Além disso, o CPC e CMC em um gradiente nulo de ácido aspártico são 0,03 e 0,02, respectivamente, e indicam a falta de parcialidade na migração, na ausência de um gradiente.

Figura 1. Esquemática do dispositivo e gradiente de concentração.
(A) Representação esquemática do dispositivo quimiotaxia microfluídicos. O dispositivo consiste de um módulo de gradiente de mistura (20 x 100 x 18.750 mm) e um módulo quimiotaxia de observação (20 x 1050 x 11500 mm). As larguras dos dois canais gradiente de entrar no dispositivo são 500 mm ea largura da entrada da bactéria é 50 mm. A inserção mostra um gradiente de molécula sinalizadora (cinza) e bactérias migrar em resposta a ele. Bactérias vivas são descritas como formas ovais sólida, enquanto que bactérias mortas são mostrados como ovais aberto. (B) um gradiente de concentração entre 0 e 100 ng / mL de fluoresceína foi gerada no dispositivo e fotografada usando microscopia de fluorescência. Imagens de fluorescência foram adquiridas após 30 min e quantificadas por análise de imagem.

Figura 2. Quimiotaxia de E. coli RP437 no dispositivo microfluídicos.
E. coli RP437 foi exposto a um gradiente de (A) 0-100 mM L-aspartato ou (B) 0-225 mM NISO ₄ no dispositivo e a migração de bactérias vivas (verde) em direção a L-aspartato ou longe de níquel imaged cada segundo de 2,5 para 30 min. Bactérias mortas (vermelho) serviu como controle dos efeitos de fluxo no dispositivo. As imagens foram quantificados utilizando um in-house desenvolveu análise Program3. Os dados apresentados são representativos pseudo-colored imagens a partir de três experimentos independentes.

Figura 3: Quantificação de perfis de migração para um atrativo canônica e repelente.
Distribuição espacial da RP437 no dispositivo microfluídicos em resposta a (A) 100 uniformes mM L-aspartato (ie, sem gradiente), (B) um 0 gradiente M 100 de aspartato, e (C) um 0 gradiente M 225 da NISO ₄ . A distribuição de células mortas é mostrado como uma linha sólida, a distribuição das células RP437 é mostrado como uma linha tracejada, ea distribuição de células RP437 eda ⁺ Δ tar é mostrado como uma linha pontilhada. Os dados apresentados são uma média de três experimentos independentes.

Discussion

O coeficiente de partição quimiotaxia (CPC) eo coeficiente de migração quimiotaxia (CMC) pode ser calculado como descrito na Mao et al ^5. Se uma célula é detectada no lado de alta concentração, é dado um valor de 1, enquanto que uma célula detectada no lado de baixa concentração é dado um valor de -1. Os valores são somados e divididos pelo número total de células para gerar o CPC. O sinal do CPC (positivo ou negativo) dá a direção da migração (ou para longe de um sinal). Embora o CPC indica se as células respondem a uma substância química como um atrativo ou repelente, não quantificar a extensão da quimiotaxia. Para isso, calcula-se a CMC dividindo-se o perfil de distribuição espacial de bactérias em toda a largura do dispositivo em 64 seções (32 em cada lado da entrada da célula), e atribuir um fator de ponderação para as células em cada seção com base na distância de migração. As seções mais distantes do centro (seções 1 e 64) são multiplicados por um (= 31.5/31.5) ou -1, já que contêm células que migraram a distância máxima. As próximas duas seções (2 e 63) são multiplicados por 0,968 (= 30.5/31.5) ou -0,968. As duas últimas seções (ou seja, 32 e 33 que estão mais próximos à entrada da célula) são multiplicados por 0,015 + (= 0.5/31.5) ou -0,015. Os valores ponderados são somados e normalizados para o número total de células para gerar o CMC. A CMC de 1 indica que todas as bactérias mudaram completamente o gradiente para a parede da câmara de fluxo. No caso de uma resposta suave atrativo, o CMC ainda seria positivo, mas tem um valor menor, enquanto o valor CPC ainda seria um. Assim, o CMC discrimina células reativas com base na extensão da migração.

Alguns parâmetros precisam ser cuidadosamente controlados durante a execução de experimentos de quimiotaxia. A temperatura na qual as bactérias são cultivadas é importante. Para E. coli, temos observado que a melhor temperatura de crescimento é de 32 ° C e temperaturas mais elevadas reduzem a motilidade. Para os receptores certos para estar presente em bactérias, pode ser necessário para crescer as bactérias na presença de um indutor chemoeffector (ie, para preparar as células para quimiotaxia). Por exemplo, ao investigar a resposta das bactérias aos maltose, as células são cultivadas com 0,1% (w / v) do açúcar. Quando ressuspender a bactéria após a centrifugação, é importante que leve agitação / rolamento do tubo é realizada e as células não são agitadas. Agitação vigorosa pode cisalhamento flagelos e reduzir a motilidade das células está sendo testado. As taxas de fluxo utilizada no dispositivo terá de ser determinado com base na motilidade da bactéria a ser testado. Taxas de fluxo mais lento pode ser necessária para que as bactérias que são menos móveis, ea taxa de fluxo ideal deve ser determinada empiricamente.

Prevemos que o dispositivo μFlow podem ser usados ​​para investigações fundamentais da quimiotaxia bacteriana (por exemplo, a concorrência entre chemoeffectors para o mesmo receptor), bem como na identificação de bactérias em amostras ambientais que respondem a determinados produtos químicos como atrativos ou repelentes.