Un dispositivo a microfluidi per quantificare chemiotassi batterica in gradienti di concentrazione stabile

Summary

Questo protocollo descrive lo sviluppo di un dispositivo a microfluidi per indagare chemiotassi batterica in gradienti di concentrazione stabile di chemoeffectors.

Abstract

Chemiotassi permette ai batteri di approccio fonti di sostanze chimiche attractant o per evitare le fonti di sostanze repellenti. I batteri di monitorare costantemente la concentrazione di chemoeffectors specifiche confrontando la concentrazione attuale alla concentrazione rilevata pochi secondi prima. Questo confronto determina la direzione netto di movimento. Anche se diversi, i gradienti concorrenti spesso coesistono in natura, gli approcci convenzionali per lo studio chemiotassi batterica non sono ottimali per quantificare la migrazione in risposta a gradienti di concentrazione di attrattivi e repellenti. Qui, descriviamo lo sviluppo di un modello di chemiotassi microfluidica per presentare i gradienti di concentrazione precisa e stabile di chemoeffectors a batteri e quantitativamente indagando la loro risposta al gradiente applicato. Il dispositivo è versatile in quanto gradienti di concentrazione di qualsiasi concentrazione desiderata in assoluto e la forza del gradiente può essere facilmente generato da miscelazione diffusivo. Il dispositivo è dimostrata utilizzando la risposta del

Protocol

1. Fabbricazione di maestri silicio utilizzando le normali SU-8 fotolitografia ¹ (non mostrato in questo video).

1. Uso standard SU-8 metodi di fotolitografia per creare un SU-8 "master" (SU-8 2025, MicroChem, Newton, MA) per la realizzazione dello stampo PDMS che contiene la rete microfluidica e la camera di chemiotassi. Stampi maestro tale può essere fabbricato in qualunque impianto di microfabbricazione (ad esempio, Stanford Microfluidica Fonderia; http://thebigone.stanford.edu/foundry/ ).
2. Prima della replica PDMS, esporre il SU-8 master fluorosilane vapore in un essiccatore collegato ad una fonte di vuoto per facilitare il rilascio facile PDMS dal master. Aggiungere una goccia di fluorosilane ad un tovagliolo di carta e si applicano a vuoto per un min. Rimuovere il vuoto e attendere 30 minuti per la deposizione di fluorosilane. Tenere il SU-8 master in un contenitore chiuso per un uso futuro.

2. Stampaggio replica del PDMS da SU-8 master: Lo strato di fluidi e il livello di controllo sono realizzati per stampaggio replica del PDMS da SU-8 master.

1. Miscelare il PDMS pre-polimero e cross-linker ad un peso 10:1. rapporto e Degas in essiccatore per 1 ora (o fino a quando le bolle d'aria vengono rimossi dalla miscela PDMS).
2. Posizionare il SU-8 master in una capsula di Petri e con attenzione versare il composto PDMS sulla parte superiore del SU-8 master per lo spessore desiderato.
3. Riscaldare la capsula di Petri contenente il PDMS e il SU-8 stampo maestro a 80 ° C per due ore per curare il PDMS.
4. Rimuovere il curato PDMS coperto SU-8 master dalla piastra e la buccia di stampo PDMS dal SU-8 master. La struttura desiderata verrà incorporato nello stampo PDMS.
5. Fori pugno nello stampo PDMS per tubi al generatore di gradiente e di ingresso delle cellule utilizzando un calibro 20 smussato-end ago.

3. Incollaggio di dispositivi PDMS:

1. Pulire un vetrino da microscopio in vetro con isopropanolo e asciugare con azoto o un flusso d'aria.
2. Esporre il PDMS e vetrino di plasma di ossigeno in un plasma asher.
3. Portare lo stampo PDMS a contatto con il vetrino. Calore la diapositiva contattato e PDMS stampo a 65 ° C per 15 min.

4. Montaggio del dispositivo PDMS

1. Utilizzando una lama di rasoio, taglio tubi ad un angolo di 45 ° la lunghezza corretta necessaria per il dispositivo.
2. Inserire un'estremità del tubo nel fori nel dispositivo (ad esempio, outlet) con pinze.
3. Uso di pinze, inserire un brusco da 30 gauge in l'altra estremità del tubo.
4. Ripetere il punto 4.2 per tutte le lacune ancora esistenti.
5. Raccogliere 1 ml di buffer di chemiotassi (CB) in una siringa da 3 ml, avendo cura di eliminare le bolle d'aria dalla siringa.
6. Fissare un hub ago per una estremità del tubo di uscita.
7. Aggiungi CB al mozzo ago, e toccare il mozzo ago per rimuovere eventuali bolle d'aria.
8. Spingere un po 'fuori CB della punta della siringa e collegare la siringa 3 ml al mozzo dell'ago senza intrappolare l'aria.
9. Spingere CB attraverso il dispositivo fino a quando tutti gli hub ago rimanenti sono pieni di CB. Questo dovrebbe rimuovere la maggior parte delle bolle d'aria.
10. Riempire due siringhe 500μL con CB contenente le concentrazioni adeguate di chemoeffector in fase di test. Eliminare la formazione di bolle d'aria, spingendo fuori una piccola goccia dei contenuti siringa e toccare la goccia di liquido nel mozzo ago e fissaggio.
11. Allo stesso modo, collegare una siringa contenente CB verso l'ingresso del batterio. Questo sarà rimosso quando i batteri vengono introdotti nel dispositivo.

5. Crescita altamente mobili E. coli

1. Grow culture durante la notte di E. coli RP437 con un'espressione GFP plasmide in 20 ml di brodo triptone (TB) a 32 ° C con agitazione. Aggiungi concentrazioni di antibiotico appropriato per mantenere il plasmide. Nel nostro protocollo, utilizziamo una pCM182 plasmide basso copia per la rilevazione di batteri sulla base di fluorescenza nel dispositivo. Per E. coli, le culture in crescita a 32 ° C è raccomandata per la motilità elevato, come la motilità è inferiore a temperature più elevate.
2. Utilizzare la lingua durante la notte per inoculare a 20 mL di cultura TB in un Erlenmeyer da 250 ml a una densità ottica a 600nm di ~ 0,05. Far crescere la coltura in agitazione a 32 ° C.
3. Raccogliere le cellule con un diametro esterno di ₆₀₀ ~ 0,35 0,45 da bassa velocità di centrifugazione a 400 xg per 5 min.
4. Risospendere le cellule ad un diametro esterno di ₆₀₀ ~ 0.35 in CB contenente il chemoeffector alla concentrazione prevista nel bel mezzo del canale.
5. Aggiungere RFP marcato le cellule morte con un diametro esterno di ₆₀₀ ~ 0,35 alla GFP che esprimono cellule vive. I morti (rosso), le cellule vengono utilizzati come controllo interno per garantire che qualsiasi migrazione non è dovuto agli effetti del flusso.

6. Monitoraggio chemiotassi

1. Rimuovere alcuni dei CB dall'ago ingresso cellulamozzo. Riempire con la sospensione cellulare.
2. Delicatamente riempire la siringa 50μL con le cellule risospese. Questo passo deve essere fatto lentamente come flagelli possono essere tranciati e ridurre la motilità.
3. Attaccare la siringa 50μL verso l'ingresso del centro-ago come descritto al punto passi 4.10.
4. Posizionare il dispositivo sul palco di un microscopio a fluorescenza dotato di una telecamera ad alta velocità per l'acquisizione delle immagini. Posizionare le siringhe di aspirazione (sia la 500 siringhe gradiente microlitri e la siringa da 50 celle mL) nella pompa a siringa e avviare il flusso in modo tale che il gradiente è formato e le celle sono che scorre attraverso il tubo.
5. Una volta che le cellule entrano nella camera chemiotassi, attendere circa 20 minuti per il sistema si stabilizzi prima di imaging.
6. Raccogliere verde (dal vivo) e rosso (morti) le immagini di fluorescenza a diverse posizioni lungo la lunghezza della camera (corrispondenti a diversi tempi di esposizione). Di solito, raccogliamo 100 immagini in ogni posizione ad intervalli di 3 secondi.

7. Analisi dei dati: la procedura seguente può essere eseguito utilizzando qualsiasi programma di analisi disponibili in commercio di immagini (ad esempio, ImageJ, Metamorph) o con semplici codici scritti in Matlab.

1. Rimuovere i pixel di sfondo dell'immagine (cioè la soglia di intensità dei pixel e rimuovere tutti i pixel che hanno un'intensità inferiore alla soglia). Questo riduce al minimo rumore nell'analisi.
2. Utilizzare la posizione delle cellule morte (fluorescenza rossa) per determinare il centro dell'immagine. Dal momento che le cellule morte non mostrano chemiotassi, questa rappresenta la posizione in cui le cellule entrato nella camera di chemiotassi e sarebbe rilevato in assenza di migrazioni.
3. Individuare le cellule vive (fluorescenza verde) nell'immagine.
4. Dividere l'immagine in canali e determinare il numero di cellule vive in ogni canale. Nel nostro lavoro precedente ^3, il micron 1050 chemiotassi ampia camera era divisa in 64 canali che sono ogni ~ 16 micron di larghezza.
5. Ripetere i passi 7,1 7.3 per tutte le immagini e la somma del numero di cellule totale per ogni canale in tutte le immagini. Questo dà il conteggio totale delle cellule rilevato in ciascun canale per tutta la durata dell'esperimento.
6. Calcolare il coefficiente di partizione chemiotassi (CPC), che rappresenta la direzione della migrazione, come segue: ogni cellula si trova nella alta concentrazione (a destra) e bassa concentrazione (a sinistra) i lati della cellule morte viene assegnato un moltiplicatore pari a +1 e -1 , rispettivamente. Ovvero, una cellula che migra un gradiente viene moltiplicata per 1, mentre le cellule in movimento lungo il gradiente sono moltiplicati per -1. Tutti i valori moltiplicati vengono sommati e normalizzati al numero totale di cellule rilevate. Per esempio, un valore CPC di 0,40 indica che il 40% in più dei batteri totale spostato sul lato alta concentrazione rispetto al lato bassa concentrazione (cioè la chemoeffector è un attrattivo come più batteri sono stati rilevati in movimento il gradiente).
7. Calcolare il coefficiente di migrazione chemiotassi (CMC), che pesa la migrazione delle cellule dalla distanza percorsa, come segue: Peso contare le celle in ogni canale di un fattore che è proporzionale alla distanza che le cellule migrano. Una cellula che si muove di più lontano ad alta concentrazione di posizione (canale 64) viene assegnato un fattore di ponderazione di +1, mentre quello che si muove a metà strada nel lato maggiore concentrazione è assegnato un fattore di ponderazione di 0,5, e una cellula di passare al più lontano bassa concentrazione posizione ponderata per -1. Sommare tutti i conteggi delle cellule ponderato e normalizzare il numero di cellule per generare il CMC.

Risultati Rappresentante ^3,4:

Abbiamo usato il dispositivo a microfluidi (Figura 1A) descritto qui di indagare chemiotassi di E. coli in gradienti di attrattivi (acido aspartico, autoinducer-2) e repellenti (NISO _4, indolo) ^3,4. Il prototipo chemiotassi ceppo ⁵ E. coli RP437 GFP che esprimono è stato utilizzato, insieme a kanamicina, ucciso E. coli TG1 cellule che esprimono proteine ​​fluorescenti rossi per monitorare gli effetti del flusso. Il gradiente di concentrazione formata nel dispositivo μFlow è mostrato nella Figura 1B. L'ingresso cella era massimale, in modo che non vi era alcun flusso attraverso di essa e un gradiente stabile di 0 100 è stata fondata ng / mL di fluoresscein nel dispositivo. L'intensità dei pixel attraverso il dispositivo è stato utilizzato per determinare il profilo di concentrazione di fluorescina. I dati mostrano che i batteri incontrano una sfumatura lineare quando entrano nella camera di chemiotassi. Figura 2A e B mostra le immagini di fluorescenza di E. coli RP437 migrare in risposta a gradienti di acido aspartico (0 100 mM) e Niso ₄ (0 225 mM). Le risposte osservate a questi attrattivo canonico e repellenti sono come previsto. 3A La figura mostra la distribuzione quantificati di E. coli RP437 in assenza di un gradiente di concentrazione (cioè, il gradiente nullo di acido aspartico), mentreFigure 3B e C mostrano la distribuzione in gradienti di acido aspartico e NISO _4. La specificità di queste risposte (cioè, il bias in migrazione) è evidente come E. coli RP437 Δ catrame ceppo (cioè privi del ceppo chemoreceptor Tar che viene utilizzato in E. coli a senso acido aspartico e nichel) non dimostra la parzialità nella migrazione, in presenza di un gradiente di concentrazione di acido aspartico o NISO _4. Le tendenze evidenti nei profili di distribuzione spaziale sono inoltre coerenti con i valori calcolati CPC e CMC. I valori CPC per la migrazione di E. coli RP437 in gradienti di acido aspartico o Niso ₄ sono 0,33 e -0,33, rispettivamente. I corrispondenti valori CMC sono 0,13 e -0,14, rispettivamente. Al contrario, la CPC e CMC valori con la E. coli RP437 Δ ceppo di catrame in gradienti di acido aspartico o Niso ₄ sono trascurabili. Inoltre, il CPC e CMC in un gradiente nullo di acido aspartico sono 0,03 e 0,02, rispettivamente, e indicano la mancanza di pregiudizi nella migrazione, in assenza di un gradiente.

Figura 1. Dispositivo schematica e gradiente di concentrazione.
(A) Rappresentazione schematica del dispositivo chemiotassi microfluidica. Il dispositivo è costituito da un gradiente di miscelazione modulo (20 x 100 x 18750 micron) e un modulo di osservazione chemiotassi (20 x 1050 x 11500 micron). Le larghezze dei due canali gradiente entrare nel dispositivo sono 500 micron e la larghezza della presa batteri è di 50 micron. L'inserto mostra un gradiente di molecola di segnalazione (grigio) e batteri migrano in risposta ad essa. Batteri vivi sono dipinti come ovali solido, mentre i batteri morti sono mostrati come ovali aperte. (B) Un gradiente di concentrazione tra 0 e 100 ng / mL fluoresceina è stata generata in dispositivo e ripreso usando la microscopia a fluorescenza. Immagini di fluorescenza sono state acquisite dopo 30 minuti e quantificato l'analisi dell'immagine.

Figura 2. Chemiotassi di E. coli RP437 nel dispositivo microfluidica.
E. coli RP437 è stato esposto ad un gradiente di (A) 0-100 mM L-aspartato (B) 0-225 mM NISO ₄ nel dispositivo e la migrazione di batteri vivi (verde) in direzione di L-aspartato o lontano da nichel ripreso ogni 2,5 sec per 30 min. Batteri morti (rosso) è servito come il controllo per gli effetti del flusso nel dispositivo. Le immagini sono state quantificate con un in-house ha sviluppato l'analisi program3. I dati riportati sono rappresentativi pseudo-colore delle immagini provenienti da tre esperimenti indipendenti.

Figura 3: Quantificazione dei profili di migrazione a un attrattivo canonica e repellente.
Distribuzione spaziale dei RP437 nel dispositivo a microfluidi in risposta a (A) uniforme 100 mM L-aspartato (cioè, senza pendenza), (B) un gradiente 0 100 mM di aspartato, e (C) un gradiente 0 225 mM di NISO ₄ . La distribuzione delle cellule morte viene visualizzato come una linea continua, la distribuzione di cellule RP437 è indicato come una linea tratteggiata, e la distribuzione di RP437 eda ⁺ Δ cellule tar è mostrata come una linea tratteggiata. I dati riportati sono una media di tre esperimenti indipendenti.

Discussion

Il coefficiente di partizione chemiotassi (CPC) e il coefficiente di migrazione chemiotassi (CMC) può essere calcolato come descritto in Mao et al ^5. Se una cellula viene rilevato sul lato alta concentrazione, si è dato un valore di +1, mentre una cella individuata sul lato bassa concentrazione viene assegnato un valore di -1. I valori sono riassunti e diviso per il numero totale di cellule per generare il CPC. Il segno del CPC (positivo o negativo) dà la direzione della migrazione (verso o lontano da un segnale). Anche se il CPC indica se le cellule rispondono a una sostanza chimica come un attrattivo o repellente, senza quantificare l'entità della chemiotassi. Per questo, calcolare il CMC dividendo il profilo della distribuzione spaziale dei batteri per tutta la larghezza del dispositivo in 64 sezioni (32 su ciascun lato della cella di ingresso), e assegnando un fattore di ponderazione per le cellule in ogni sezione in base alla distanza di migrazione. Le sezioni più lontane dal centro (sezioni 1 e 64) vengono moltiplicati per uno (= 31.5/31.5) o -1 poiché contengono cellule che hanno migrato la distanza massima. Le due sezioni successive (2 e 63) sono moltiplicate per 0,968 (= 30.5/31.5) o -0,968. Le ultime due sezioni (vale a dire, 32 e 33 che sono più vicini alla presa di cella) sono moltiplicate per + 0,015 (= 0.5/31.5) o -0,015. I valori ponderati sono sommati e normalizzati per il numero totale di cellule per generare il CMC. La CMC di +1 indica che tutti i batteri spostato completamente il gradiente alla parete della camera di flusso. Nel caso di una risposta mite attraente, il CMC sarebbe ancora positivo, ma hanno un valore inferiore, mentre il valore CPC sarebbe ancora +1. Così la CMC discrimina le cellule sensibili in base al grado di migrazione.

Alcuni parametri devono essere attentamente controllati durante l'esecuzione di esperimenti di chemiotassi. La temperatura alla quale vengono coltivati ​​i batteri è importante. Per E. coli, abbiamo osservato che la temperatura migliore crescita è 32 ° C e le temperature superiori riducono la motilità. Per i recettori certo di essere presenti nei batteri, può essere necessario per crescere i batteri in presenza di una induzione chemoeffector (cioè, per primo le cellule per chemiotassi). Per esempio, quando indagando la risposta dei batteri a maltosio, le cellule sono coltivate con il 0,1% (w / v) dello zucchero. Quando risospendere i batteri dopo la centrifugazione, è importante che dolce scuotendo / a rotazione del tubo viene eseguita e le cellule non sono in agitazione. Agitazione violenta possibile taglio i flagelli e di ridurre la motilità delle cellule in fase di test. Le portate utilizzate nel dispositivo dovrà essere determinato sulla base della motilità del batterio in fase di test. Portate più lento può essere richiesto per i batteri che sono meno mobili, e la portata ottimale deve essere determinata empiricamente.

Prevediamo che il dispositivo μFlow può essere utilizzato per le indagini fondamentale sulla chemiotassi batterica (per esempio, la concorrenza tra chemoeffectors per il recettore stesso) così come per identificare i batteri in campioni ambientali che rispondono a particolari sostanze chimiche come attrattivi o repellenti.