Summary
Se describe un protocolo para la cuantificación rápida y sensible de la gravedad de la enfermedad en modelos de ratón de la ataxia cerebelosa. Las medidas incluyen las extremidades posteriores juntando, la cornisa de la prueba, la marcha y la cifosis. Este protocolo efectivamente discrimina entre los individuos afectados y no afectados, y detecta la progresión de las personas afectadas con el tiempo.
Abstract
Se describe un protocolo para la cuantificación rápida y sensible de la gravedad de la enfermedad en modelos de ratón de cerebelo ataxia. Se deriva de las evaluaciones fenotipo previamente publicado en varios modelos de enfermedades, incluyendo las ataxias espinocerebelosas, la enfermedad de Huntington y la atrofia muscular s espinobulbar. Las medidas incluyen las extremidades posteriores juntando, la cornisa de la prueba, la marcha y la cifosis. Cada medida se registra en una escala de 0-3, con un total combinado de 0-12 para las cuatro medidas. Los resultados efectivamente discriminar entre los individuos afectados y no afectados, al tiempo que la cuantificación de la progresión temporal de los fenotipos de la enfermedad neurodegenerativa. Las medidas pueden ser analizados de forma individual o combinados en una puntuación fenotipo compuesto de una mayor potencia estadística. La combinación ideal de las cuatro medidas descritas dependerá de la enfermedad en cuestión. Se presenta un ejemplo del protocolo utilizado para evaluar la gravedad de la enfermedad en un modelo de ratón transgénico de la ataxia espinocerebelosa tipo 7 (SCA7).
Albert R. La Spada y Gwenn A. Jardín contribuido a este manuscrito por igual.
Protocol
Para evitar sesgos, el investigador de realizar las evaluaciones no deben tener un conocimiento del genotipo de los animales. Las medidas individuales se califican en una escala de 0-3, donde 0 representa la ausencia del fenotipo relevante y 3 representan la manifestación más grave. Cada ensayo se realiza varias veces para asegurarse de que el resultado es reproducible. La obesidad se complican la interpretación de todas las medidas descritas. El investigador puede desear para pesar los ratones después de anotar fenotipo para evaluar el posible papel de la adiposidad en los resultados.
Repisa de la prueba
La prueba de borde es una medida directa de la coordinación, que se ve afectada en ataxias cerebelosas y muchos otros trastornos neurodegenerativos. Esta medida es la más directamente comparables a los signos humanos de ataxia cerebelosa.
- Levantar el ratón de la jaula y colocarlo en la repisa de la jaula. Los ratones normalmente caminar por la cornisa y tratar de descender de nuevo en la jaula.
- Observe el ratón a medida que camina por la cornisa jaula y se reduce en su jaula. Un ratón de tipo salvaje normalmente caminar por la cornisa sin perder su equilibrio, y se baja de la espalda en la jaula con gracia, con sus patas. Esto se le asigna una puntuación de 0. Si el ratón pierde su equilibrio mientras camina por la cornisa, pero por lo demás parece coordinada, que recibe una puntuación de 1. Si no lo hace eficaz el uso de sus patas traseras, o cae de cabeza en lugar de sus patas cuando se desciende en la jaula, que recibe una puntuación de 2. Si se cae de la repisa, o casi, al caminar o tratar a sí mismo inferior, o se sacude y se niega a moverse en absoluto a pesar del estímulo, que recibe una puntuación de 3. Algunos ratones se requiere un pequeño empujoncito para animar a caminar por la cornisa o descender en la jaula.
- Registrar la calificación de la prueba cornisa.
Miembro Posterior juntando
Miembro Posterior juntando es un marcador de progresión de la enfermedad en una serie de modelos de ratón de la neurodegeneración, incluyendo ciertas ataxias cerebelosas [1].
- Sujete la cola cerca de su base y levantar el ratón clara de todos los objetos que lo rodean.
- Observar la posición de miembro posterior durante 10 segundos. Si las patas traseras son siempre abiertas hacia el exterior, lejos del abdomen, se le asigna una puntuación de 0. Si un miembro posterior se retrae hacia el abdomen desde hace más de 50% del tiempo suspendido, que recibe una puntuación de 1. Si ambos miembros posteriores son parcialmente retraído hacia el abdomen desde hace más de 50% del tiempo suspendido, que recibe una puntuación de 2. Si sus extremidades posteriores son completamente retraído y tocando el abdomen en busca de más del 50% del tiempo suspendido, que recibe una puntuación de 3.
- Coloque el ratón de nuevo en su jaula, y registrar su puntuación de extremidades inferiores juntando.
Paso
La marcha es una medida de la coordinación y la función muscular.
- Quitar el ratón de su jaula y lo coloca sobre una superficie plana con la cabeza de espaldas a la investigadora.
- Observe el ratón desde atrás a medida que camina. Si el ratón se mueve con normalidad, con apoyo del peso corporal en todas las extremidades, con el abdomen sin tocar el suelo, y con las dos patas traseras que participan por igual, que recibe una puntuación de 0. Si se muestra un temblor o parece cojear al caminar, que recibe una puntuación de 1. Si se muestra un temblor intenso, cojera severa, disminución de la pelvis o los pies apuntan lejos del cuerpo durante la locomoción ("pies de pato"), que recibe una puntuación de 2. Si el ratón tiene dificultades para seguir adelante y arrastra a su abdomen por el suelo, recibe una puntuación de 3.
- Coloque el ratón de nuevo en su jaula, y registrar su puntuación de la marcha.
Cifosis
La cifosis es una curvatura característica dorsal de la columna vertebral que es una manifestación frecuente de enfermedades neurodegenerativas en modelos de ratón [2]. Es causada por una pérdida de tono muscular en los músculos de la columna vertebral secundaria a la neurodegeneración.
- Quitar el ratón de su jaula y lo coloca sobre una superficie plana.
- Observe que a medida que camina. Si el ratón es capaz de enderezar su columna vertebral con facilidad a medida que camina, y no tiene cifosis persistente, que recibe una puntuación de 0. Si el ratón presenta cifosis leve, pero es capaz de enderezar su columna vertebral, que recibe una puntuación de 1. Si no es capaz de enderezar su columna vertebral completamente y mantiene la cifosis persistente pero leve, que recibe una puntuación de 2. Si mantiene el ratón cifosis pronunciada a medida que camina o mientras se está sentado, se le asigna una puntuación de 3.
- Coloque el ratón de nuevo en su jaula, y registrar su puntuación de la cifosis.
Los resultados representativos
Con un número suficiente de animales, este procedimiento es capaz de detectar diferencias fenotípicas entre las cepas y dentro de la misma cepa en el tiempo. Para el análisis de los datos, calcular la puntuación para cada medida mediante la adopción de lamedia de las tres mediciones en cada individuo. Las medidas se pueden analizar por separado o combinados en una puntuación compuesta fenotipo de cada individuo.
Gráfico de los datos y aplicar los métodos estadísticos apropiados para determinar la significación. La figura 1 muestra los resultados de una evaluación de fenotipo compuesto de un anticuerpo murino transgénico SCA7 modelo. En este modelo transgénico floxed-SCA7-92Q, el ser humano ataxina-7 genes con 92 repeticiones de CAG está flanqueado por sitios loxP y expresa a partir de un cromosoma artificial bacteriano. La puntuación fenotipo compuesto incluye el juntando, caminar cornisa, la marcha y evaluación de la cifosis de una puntuación máxima posible de 12. La progresiva SCA7 fenotipo de los ratones transgénicos floxed-SCA7-92Q se demuestra con una puntuación de fenotipo aumento compuesto, lo cual es consistente con la naturaleza progresiva de la enfermedad humana.
. Figura 1 floxed-SCA7-92Q ratones muestran una progresiva SCA7 fenotipo que es significativamente diferente de los no transgénicos de camada a partir de las 20 semanas (2-way ANOVA: Bonferroni post-hoc; *** P <0,001). Los ratones fueron evaluados en una escala de 0-3 cada uno para la prueba de cornisa, cruzando, la marcha, y la cifosis. Promedio total para cada genotipo en cada edad se calculó. Las barras representan SEM.
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Discussion
Este protocolo está diseñado para ser una evaluación sensible y realizar fácilmente de gravedad de la enfermedad en modelos de ratón de la ataxia cerebelosa. Los componentes individuales del sistema de puntuación será más o menos eficaz en modelos de ratón diferente de la neurodegeneración.
Los elementos de este sistema de puntuación han sido efectivamente utilizados para evaluar una variedad de modelos de ratón de las enfermedades neurodegenerativas humanas, incluyendo las ataxias cerebelosas, la enfermedad de Huntington y la atrofia s espinobulbar muscular [1-3]. La combinación ideal de las pruebas dependerá de la enfermedad en cuestión. Este protocolo fue diseñado originalmente por los autores para evaluar los modelos de ratones transgénicos de la ataxia espinocerebelosa tipo 7 (SCA7).
En el modelo de SAC7 empleados para generar los datos presentados aquí, los animales fueron sacrificados a la edad de 40 a 43 semanas o antes si las anomalías en el comportamiento progresado a una etapa que el animal ya no es lo suficientemente móviles para mantener de forma independiente la nutrición o hidratación.
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Disclosures
Estos estudios fueron aprobados por la Universidad de Washington Cuidado de Animales institucional y el empleo.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por subvenciones del NIH NS052535 de GAG y EY014061 y EY014997 a ARL, así como un premio UL1DE019583-02 del consorcio.
References
- Chou, A. H. Polyglutamine-expanded ataxin-3 causes cerebellar dysfunction of SCA3 transgenic mice by inducing transcriptional dysregulation. Neurobiol Dis. 31 (1), 89-101 (2008).
- Thomas, P. S. Jr Loss of endogenous androgen receptor protein accelerates motor neuron degeneration and accentuates androgen insensitivity in a mouse model of X-linked spinal and bulbar muscular atrophy. Hum Mol Genet. 15 (14), 2225-2238 (2006).
- Ditzler, S., Stoeck, J., LeBlanc, M., Kooperberg, C., Hansen, S., Coppin, L., Olson, J. M. A Rapid Neurobehavioral Assessment Reveals that FK506 Delays Symptom Onset in R6/2 Huntington's Disease Mice. Preclinica Research Articles. 1 (3), 115-126 (2003).
