Un simple système de notation composite phénotype pour l'évaluation des modèles murins de l'ataxie cérébelleuse

Summary

Nous décrivons un protocole pour la quantification rapide et sensible de la gravité de la maladie dans des modèles murins de l'ataxie cérébelleuse. Les mesures comprennent des membres postérieurs en joignant, corniche de test, la démarche et une cyphose. Ce protocole est discriminatoire efficace entre les individus affectés et non affectés, et détecte la progression des personnes touchées au cours du temps.

Abstract

Nous décrivons un protocole pour la quantification rapide et sensible de la gravité de la maladie dans des modèles murins de cervelets ataxie. Il est dérivé du phénotype des évaluations précédemment publiées dans les modèles de plusieurs maladies, y compris les ataxies spino-cérébelleuse, maladie de Huntington et de spinobulbar atrophie musculaire. Les mesures comprennent des membres postérieurs en joignant, corniche de test, la démarche et une cyphose. Chaque mesure est enregistrée sur une échelle de 0-3, avec un total combiné de 0-12 pour les quatre mesures. Les résultats effectivement une discrimination entre les individus affectés et non affectés, tout en quantifiant l'évolution temporelle des phénotypes des maladies neurodégénératives. Les mesures peuvent être analysées individuellement ou combinés en un score composite pour le phénotype plus grande puissance statistique. La combinaison idéale des quatre mesures décrites dépendra de la maladie en question. Nous présentons un exemple de protocole utilisé pour évaluer la gravité des maladies dans un modèle de souris transgénique de l'ataxie spinocérébelleuse de type 7 (SCA7).

Albert R. La Spada et Gwenn A. Jardin contribué à ce manuscrit même.

Protocol

Pour éviter les biais, l'expérimentateur effectuer les évaluations ne doivent pas avoir une connaissance du génotype de l'animal. Les mesures individuelles sont notés sur une échelle de 0-3, où 0 représente une absence de phénotype pertinent et 3 représentant la manifestation la plus sévère. Chaque test est effectué plusieurs fois pour s'assurer que le score est reproductible. L'obésité va compliquer l'interprétation de toutes les mesures décrites. L'enquêteur peut souhaiter peser les souris après notation phénotype d'évaluer le rôle possible de l'adiposité dans les résultats.

Test de Ledge

Le test de corniche est une mesure directe de la coordination, qui est altérée dans les ataxies cérébelleuses et beaucoup d'autres maladies neurodégénératives. Cette mesure est la plus directement comparable à des signes d'ataxie cérébelleuse humaine.

1. Soulevez la souris à partir de la cage et la placer sur le rebord de la cage. Souris typiquement longez la corniche et de tenter de redescendre dans la cage.
2. Respecter les souris comme il marche le long de la corniche cage et s'abaisse dans sa cage. Une souris de type sauvage est généralement marcher le long de la corniche, sans perdre son équilibre, et va se le bas du dos dans la cage gracieusement, en utilisant ses pattes. Ceci est attribué un score de 0. Si la souris perd pied en marchant le long de la corniche, mais apparaît autrement coordonnée, il reçoit un score de 1. S'il n'utilise pas efficacement ses pattes postérieures, ou des terres sur sa tête plutôt que ses pattes en descendant dans la cage, il reçoit un score de 2. Si elle tombe de la corniche, ou presque, tout en marchant ou en tentant de se baisse, ou tremble et refuse de bouger du tout en dépit des encouragements, il reçoit un score de 3. Certaines souris nécessitera un petit coup de pouce pour les encourager à marcher le long de la corniche, ou descendre dans la cage.
3. Notez le score au test rebord.

Hindlimb joignant

Hindlimb serrant est un marqueur de progression de la maladie dans un certain nombre de modèles de souris de la neurodégénérescence, y compris certaines ataxies cérébelleuses [1].

1. Saisir la queue près de sa base et soulevez la souris claire de tous les objets environnants.
2. Observer la position des membres postérieurs pendant 10 secondes. Si les membres postérieurs sont systématiquement écartés vers l'extérieur, loin de l'abdomen, il est attribué un score de 0. Si l'un des membres postérieurs est rétracté vers l'abdomen pendant plus de 50% du temps suspendu, il reçoit un score de 1. Si les deux membres postérieurs sont partiellement rétractée vers l'abdomen pendant plus de 50% du temps suspendu, il reçoit un score de 2. Si ses membres postérieurs sont entièrement rétracté et toucher le ventre pour plus de 50% du temps suspendu, il reçoit un score de 3.
3. Placez la souris de nouveau dans sa cage et enregistrer son score en joignant des membres postérieurs.

Démarche

La démarche est une mesure de coordination et de la fonction musculaire.

1. Retirez la souris de sa cage et la placer sur une surface plane avec sa tête tournée vers l'enquêteur.
2. Observez la souris par derrière comme il marche. Si la souris se déplace normalement, avec son poids en charge sur tous les membres, avec son abdomen ne pas toucher le sol, et avec les deux membres postérieurs qui participent régulièrement, il reçoit un score de 0. Si elle montre un tremblement ou apparaît à boiter en marchant, il reçoit un score de 1. Si elle montre un tremblement sévère, boites sévères, a abaissé le bassin, ou le point de pieds loin du corps lors de la locomotion («pieds de canard»), il reçoit un score de 2. Si la souris a du mal à aller de l'avant et fait glisser son abdomen sur le sol, il reçoit un score de 3.
3. Placez la souris de nouveau dans sa cage et enregistrer son score démarche.

Cyphose

La cyphose est une courbure caractéristique dorsale de la colonne vertébrale qui est une manifestation fréquente des maladies neurodégénératives dans des modèles murins [2]. Elle est causée par une perte de tonus musculaire dans les muscles spinaux secondaire à une neurodégénérescence.

1. Retirez la souris de sa cage et la placer sur une surface plane.
2. Observez comme il marche. Si la souris est en mesure de facilement redresser sa colonne vertébrale comme il marche, et n'a pas cyphose persistante, il reçoit un score de 0. Si la souris montre une cyphose légère, mais est capable de redresser sa colonne vertébrale, il reçoit un score de 1. Si elle est incapable de redresser sa colonne vertébrale complètement et maintient une cyphose persistante mais doux, il reçoit un score de 2. Si la souris conserve une cyphose prononcée que ça marche ou pendant qu'il est assis, il est attribué un score de 3.
3. Placez la souris de nouveau dans sa cage et enregistrer son score cyphose.

Les résultats représentatifs

Avec un nombre suffisant d'animaux, cette procédure est capable de détecter des différences entre les souches phénotype et au sein de la même souche au cours du temps. Pour l'analyse des données, calculer le score pour chaque mesure en prenant lamoyenne des trois mesures dans chaque individu. Des mesures peuvent être analysés séparément ou combinés en un score composite de phénotype de chaque individu.

Tableau des données et appliquer les méthodes statistiques appropriées pour déterminer la signification. La figure 1 montre les résultats d'une évaluation composite d'un phénotype murin transgénique SCA7 modèle. Dans ce modèle floxés-SCA7-92Q transgéniques, l'humain ataxine-7 gène avec 92 répétitions CAG est flanqué par des sites loxP et exprimé à partir d'un chromosome artificiel bactérien. Le score composite inclut le phénotype en joignant, en marchant corniche, la démarche et les évaluations cyphose pour un score maximum possible de 12. Les progressistes SCA7 phénotype chez les souris floxés-SCA7-92Q transgénique est démontrée par un score composite de phénotype augmente, ce qui est cohérent avec la nature progressive de la maladie humaine.

. Figure 1 floxés-SCA7-92Q souris présentent une progressive SCA7 phénotype qui est sensiblement différent de non transgéniques de la même portée à partir de 20 semaines (2-way ANOVA: Bonferroni post-hoc; *** p <0,001). Les souris ont été évaluées sur une échelle 0-3 pour chacun des tests corniche, serrant, la démarche, et la cyphose. Moyenne score composite pour chaque génotype à chaque âge a été calculée. Les barres représentent SEM.

Discussion

Ce protocole est conçu pour être une évaluation sensible et facilement réalisée de la gravité de la maladie chez des souris modèles de l'ataxie cérébelleuse. Les composants individuels du système de notation sera plus ou moins efficaces dans des modèles murins différents de la neurodégénérescence.

Les éléments de ce système de notation ont été effectivement utilisés pour évaluer une variété de modèles murins de maladies neurodégénératives humaines, y compris les ataxies cérébelleuses, la maladie de Huntington et de spinobulbar atrophie musculaire [1-3]. La combinaison idéale de tests dépendra de la maladie en question. Ce protocole a été initialement conçu par les auteurs pour évaluer des modèles de souris transgéniques de l'ataxie spinocérébelleuse de type 7 (SCA7).

Dans le modèle de SAC7 employées pour générer les données présentées ici, les animaux ont été sacrifiés à l'âge de 40 à 43 semaines ou plus tôt si les anomalies comportementales atteint un stade que l'animal n'est plus suffisamment mobile pour maintenir la nutrition ou indépendamment l'hydratation.