Summary
Das Protokoll beschreibt die Proteinexpression mit der methylotrophen Hefe
Abstract
Proteinexpression in der mikrobiellen eukaryotischen Wirt Pichia pastoris bietet die Möglichkeit, große Mengen an rekombinantem Protein in einem sich schnell und einfach zu bedienen Expressionssystem zu generieren.
Als einzellige Mikroorganismen P. pastoris ist leicht zu manipulieren und wächst schnell auf kostengünstige Medien bei hohen Zelldichten. Als Eukaryoten, P. pastoris ist in der Lage, erfüllen viele der post-translationale Modifikationen von höheren eukaryotischen Zellen und die erhaltenen rekombinanten Proteinen durchgeführt unterziehen Proteinfaltung, proteolytische Prozessierung, Disulfidbindungsbildung und Glykosylierung [1].
Als methylotrophen Hefe P. pastoris ist in der Lage metabolisierenden Methanol als einzige Kohlenstoffquelle. Die starken Promotor für Alkohol-Oxidase, AOX1, ist streng reguliert und induziert durch Methanol und es ist für die Expression des Gens von Interesse verwendet werden. Dementsprechend kann die Expression des fremden Proteins durch Zugabe von Methanol zum Wachstumsmedium induziert werden [2, 3].
Ein weiterer wichtiger Vorteil ist die Sekretion des rekombinanten Proteins in das Nährmedium mit einer Signalsequenz auf das fremde Eiweiß zu den sekretorischen Weg von P. pastoris Ziel. Mit nur geringen endogenes Protein abgesondert wird, um die Medien von der Hefe selbst und ohne Zusatz von Proteinen an die Medien, baut eine heterologe Protein die Mehrheit des gesamten Proteins in das Medium und ermöglicht folgende Proteinreinigung Schritte [3, 4].
Der Vektor verwendet hier (pPICZαA) enthält die AOX1 Promotor für streng reguliert, Methanol-induzierte Expression des Gens von Interesse, die α-Faktor-Sekretion Signal für die Sekretion des rekombinanten Proteins, ein Zeocin-Resistenzgen für die Selektion in E. coli und Pichia und eine C-terminale Peptid, das die c-myc-Epitop und ein Polyhistidin (6xHis) Tag zur Detektion und Reinigung eines rekombinanten Proteins. Wir zeigen auch, Western-Blot-Analyse des rekombinanten Proteins mit dem spezifischen Anti-myc-HRP Antikörper erkennen die c-myc-Epitop auf dem übergeordneten Vektor.
Protocol
Expression von rekombinanten Proteinen in der methylotrophen Hefe Pichia pastoris
Bevor Sie dieses Protokoll zu starten, sollten Sie Ihr Gen von Interesse in Frame in einem P. geklont pastoris Elternteil Vektor und haben es sequenziert, um die korrekte Insertion des Gens von Interesse in den Vektor zu überprüfen.
Schritt I: Erstellen elektrokompetente Hefezellen, Linearisierung des Konstrukts und die Umwandlung in P. pastoris
Für diesen Schritt müssen Sie die folgenden Medien und Platten zur Hand haben:
- YPDS Platten
- 600 ml YPD-Medium
- eiskaltem sterilem Wasser
- 1 M Sorbitol
- Amicon Ultra-4 Zentrifugalfilter Geräte
- Microcon YM-30 Zentrifugalfilter Einheit
- 0,2 cm Elektroporationsküvette
- 15 mL sterile Glasröhre
- sterile Glas Pasteur Pipette
- YPDS Platten mit Zeocin
Teil 1: Herstellung von elektrokompetente Hefezellen
- Vier Tage vor der beabsichtigten Umwandlung Streifen aus P. pastoris Zellen auf einem YPDS Platte ohne Zeocin und lasse sie wachsen um 30 ° C für 1-2 Tage oder bis einzelne Kolonien zu bilden.
- Zwei Tage vor dem beabsichtigten Umwandlung wachsen 5 ml des P. pastoris-Stamm in YPD-Medium in einem 50 ml Falcon-Röhrchen bei 30 ° C über Nacht. Legen Sie die Falcon-Röhrchen in einem Kolben, um es in den Shaker zu beheben.
- Am Tag vor der Transformation zu impfen 500 ml frisches YPD-Medium in einem 2-Liter-Kolben mit 0,25 ml der Übernacht-Kultur und wachsen lassen über Nacht wieder in einem Schüttler bei 30 ° C zu einer OD 600 = 1,3 bis 1,5.
Hinweis: verdünnen Ihre Probe vor der Messung auf dem Spektralphotometer, so dass Sie ein genaues Ergebnis zu bekommen. - Der Tag der Transformation haben eiskalten sterilem Wasser und 1 M Sorbitol in der Hand. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 1500 xg für 5 Minuten bei 4 ° C. Das Pellet mit 500 ml eiskaltem, sterilem Wasser.
- Zentrifugieren Sie die Zellen wieder wie in Schritt 4. Das Pellet mit 250 ml eiskaltem, sterilem Wasser.
- Zentrifugieren Sie die Zellen wieder wie in Schritt 4. Das Pellet in 20 mL eiskaltem 1 M Sorbitol.
- Zentrifugieren Sie die Zellen wieder wie in Schritt 4. Das Pellet in 1 ml eiskaltem 1 M Sorbitol zu einem Gesamtvolumen von ca. 1,5 mL. Shop-Zellen auf Eis oder bei 4 ° C bis zur weiteren Verwendung.
Hinweis: Wir bereiten weitere elektrokompetente Zellen als benötigt und speichert sie in Aliquots von 80 ul in Mikrozentrifugenröhrchen bei -80 ° C. Wir verwenden die gespeicherten Zellen nicht länger als einen Monat.
Teil 2: Linearisierung und Konzentration der pPICZαA konstruieren
Zur Transformation linearisieren den Vektor mit Ihrem Gen von Interesse durch Restriktionsverdau. Wir verwenden das Enzym PmeI. Andere Restriktionsschnittstellen sind möglich. Sie müssen sicherstellen, dass Ihre Einlage enthält nicht die Restriktionsstelle die Sie verwenden möchten, um Ihre Vektor zu linearisieren. Für die Umwandlung in P. pastoris Sie benötigen 5-20 &mgr; g linearisierter DNA in 5-10 ul sterilem Wasser.
Auch linearisieren, konzentrieren und die Ebene Vektor (ohne Einsatz) in P. pastoris. Die Muttergesellschaft Vektor ohne den Einsatz ist eine Steuerung für den Hintergrund intrazelluläre Expression und ermöglicht es Ihnen, Ihren Ausdruck zu interpretieren.
- Thaw alle Reagenzien auf Eis, kombinieren Sie die folgenden Reagenzien und kurz zentrifugieren das Rohr, um alle Flüssigkeit auf den Boden zu bekommen, tippen Sie auf das Rohr und drehen wieder:
- x ul sterilem Wasser
- 5,0 ul 10x NEBuffer 4
- 0,5 ul 100X BSA
- bis zu 2 pg Vektor-DNA (~ 100 ng / ul)
- 2,0 ul Pme I-Enzym-Mix
Hinweis: Um ausreichend linearisierte Vektor-DNA zu erhalten bereiten die oben mix 3 oder 4 mal in getrennten Röhren und kombinieren die Lösungen, wenn die Konzentration der verdauten DNA über Amicon Ultra-Zentrifugalmühle Device. - Bei 37 ° C für 3 Stunden und Wärme der Enzym-Mix bei 65 ° C für 20 Minuten zu inaktivieren.
- In der Zwischenzeit Vorspülen einer Amicon Ultra-4 Zentrifugalfilter Gerät mit 1 ml Milli-Q Wasser, drehen Sie das Rohr bei 4000 xg für 6-8 Minuten und entsorgen Sie die Durchströmung.
Hinweis: nicht zulässig die Membran austrocknen einmal nass. Wenn Sie sich nicht mit dem Gerät nach Vorspülen, lassen Wasser auf der Membran, bis das Gerät eingesetzt wird. - Übertragen Sie die hitzeinaktiviertem Lösung aus Schritt 2, um die Pre-gespült Amicon Zentrifugalfilter Unit, drehen Sie das Rohr bei 4000 xg für 6-8 Minuten und entsorgen Sie die Durchströmung.
Hinweis: Wenn Sie mehr als eine Linearisierung Mix vorbereitet haben, vereinen alle Lösungen in eine Amicon Zentrifugalfilter Unit. - Zentrifuge, bis die Menge der Lösung auf der Amicon-Filter auf ca. 100 reduziert wird ~ 150 & mu; l. Fügen Sie ein weiteres 1,5 ml sterilem Wasser auf die leere Röhre von oben und die Lösung der Amicon Rohr und wiederholen Sie den Zentrifugationsschritt. Wash ein zweites Mal mit 1,5 ml sterilem Wasser und entsorgen Durchströmung wieder. Reduzieren Sie die letzte Band auf ~ 150 pl. Die Waschschritte entfernen Sie die restlichen Salz aus dem Puffer zur Vermeidung von Brückenbildung beim Pulsieren der Zellen.
Hinweis: Wir verwenden eine Ausschwingrotor für den Zentrifugationsschritt, einfach die verschlossene Amicon Zentrifugalfilter Gerät in einem 50 mL Falcon-Röhrchen, um es in Position zu halten während der Zentrifugation. Amicon-Filter-Geräte halten 50 ul Lösung auf dem Filter auch nach längerem Zentrifugieren. - Für weitere Konzentration der DNA-Präparation überweisen Sie die restliche DNA-Lösung aus der Amicon-Filter-Gerät mit einem Pre-gespült Microcon YM-30 Kreiselpumpen Filter Unit und spülen Sie die Amicon Rohr mit einem Aufschlag von 50 ul sterilem Wasser für alle DNA erholen. Zentrifugieren Sie die Microcon Zentrifugalfilter Einheit in einer Mikrozentrifuge bei 10.000 xg, bis der Filter ist immer noch leicht mit Flüssigkeit bedeckt ist. Nur für kurze Zeit Spin und überprüfen jede Minute, wenn nur eine kleine Menge der Flüssigkeit auf dem Filter zurückbleibt. Zur Wiederherstellung Ihrer DNA-Lösung, platzieren Sie den Filter auf den Kopf in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen und Spin in einem zweiten Zentrifugationsschritt bei 1000 xg für 3 Minuten. Das endgültige Volumen sollte nicht mehr als 10-15 ul insgesamt, sonst wird Ihre DNA könnte auch für die Transformation Schritt verdünnt werden.
Hinweis: nicht schleudern die Filtervorrichtung zu lang und lassen Sie es nicht ganz trocken, um potenzielle Probe zu verhindern. Wenn Ihre Membran trocken ist, fügen 10-15 ul sterilem Wasser auf die Membran leicht bewegen für 30 Sekunden und Wiederherstellung Ihrer DNA wie oben beschrieben.
Teil 3: Transformation in P. pastoris durch Elektroporation
- Der linearisierte und konzentrierte pPICZαA DNA mit Ihrem Einsatz ist nun bereit für die Transformation in die elektrokompetente P. pastoris-Zellen (siehe Schritt I, Teil 2). Etwa 15 Minuten vor der Transformation vorzubereiten folgende Reagenzien und Geräte: Füllen Sie ein Mikrozentrifugenröhrchen mit 1 ml 1 M Sorbitol und legen Sie sie auf Eis; statt einer 0,2 cm Elektroporationsküvette auf Eis; label ein steriles 15 mL Glasröhrchen gefüllt und haben ein steriles Glas Pasteur Pipette in die Hand.
- Transfer-80 ul der Zellen aus Stufe I, Teil 2,7 bis ein eiskalter 0,2 cm Elektroporationsküvette. Fügen Sie die konzentrierte linearisiert pPICZαA DNA-Lösung aus Schritt I, Teil 3.6 und mischen, indem Sie die Pipettenspitze von der Seite an Seite in der Elektroporationsküvette.
Hinweis: Beim Hinzufügen der DNA nur push Pipette auf die erste Anlaufstelle. Nach dem Mischen der DNA mit den Zellen schieben Pipette bis zum zweiten Anschlag und langsam aus der Küvette zu entfernen. - Inkubieren Sie die Küvette mit den Zellen auf Eis für 5 Minuten.
- Wischen Sie die Außenseite der Küvette mit einem Papiertaschentuch und Puls der Zellen nach den Parametern für die Hefe (Saccharomyces cerevisiae), wie vom Hersteller des jeweiligen Elektroporation verwendeten Gerät vorgeschlagen.
Hinweis: Wir verwenden eine Bio-Rad GenePulser mit den folgenden Bedingungen:- Ladespannung (V): 1500;
- Kapazität (uF): 25;
- Widerstand (Ω): 200.
- Sofort 1 mL eiskaltem 1 M Sorbitol in die Küvette. Übertragen Sie die Küvette Inhalt in eine sterile 15-ml-Tube mit dem sterilen Glas Pasteur Pipette.
- Lassen Sie den Schlauch inkubieren bei 30 ° C ohne Schütteln für 1,5 Stunden.
- Fügen Sie 5-7 sterilisiert Glasperlen auf vier beschrifteten YPDS-Platten mit 100 pg / mL Zeocin. Verbreiten Sie 250 ul der Elektroporation Mix aus den 15 mL Glasröhrchen auf jeder Platte. Schütteln Sie die Platte horizontal gleichmäßig verteilt die Zellen. Lassen Sie die Platte für 15 Minuten trocknen und entfernen Sie dann die Perlen aus dem Agar durch Umdrehen der Platte.
Hinweis: Wir verwenden 100 ug / mL Zeocin, um für die Transformanten bei der Verwendung der GS115 Pichia-Stamm. Die Auswahl können variieren, wenn Sie eine andere Pichia-Stamm sind. - Die Platten auf den Kopf für 2 bis 3 Tagen bei 30 ° C bis Kolonien zu bilden. Wickeln Sie die Platten in einem schwarzen Kunststoff, um den Abbau der lichtempfindlichen Zeocin verhindern. Weniger Menge des Antibiotikums in den Platten können zu falsch positiven Klone führen.
- Nach Kolonien gebildet haben, nehmen 12 Kolonien und reinigen sie durch Ausstreichen der Klone auf frischer YPDS-Platten mit 100 pg / ml Zeocin.
Step II: Protein Expression in Pichia pastoris
Für diesen Schritt müssen Sie die folgenden Medien, Platten und Reagenzien zur Hand haben:
- BMGY Medium
- Glycerin, sterilisiert
- BMMY Medium
- Methanol, sterilisiert
- EPICENTRE Hefe DNA Purification Kit
SieAußerdem benötigen Sie die folgenden Flaschen:
- 250 ml Flasche, autoklaviert
- 1 L Schikanekolben, autoklaviert
- 200 mL Becherglas, autoklaviert
Teil 1: Protein-Expression in Pichia pastoris
Alle folgenden Schritte sind auch für die transformierten Kontroll-Vektor (ohne Insert) durchgeführt.
- Wählen Sie eine einzelne Kolonie aus dem gereinigten Pichia Kolonien aus Stufe I, Teil 3,9 und impfen in 25 mL BMGY in einem sterilen 250 ml-Kolben. Wachsen bei 30 ° C in einem Schüttelinkubator (250-300 rpm) bis Kultur erreicht eine OD 600 = 2-6 (ca. 16-18 Stunden).
Hinweis: verdünnen Ihre Probe vor der Messung auf dem Spektralphotometer, so dass Sie ein genaues Ergebnis zu bekommen. Die Zellen werden in log-Wachstumsphase werden. - Wenn die Zellen über die entsprechenden OD 600 erreicht bereiten Glycerin Lager. Transfer-800 ul der 25 mL Zellkultur zu einer 2 mL Corning Tieftemperatur-Fläschchen und 200 ul der sterilisierten Glycerin. Frieren Sie das Glycerin Lager und bei -80 ° C.
- Für Hefe-DNA Aufreinigung, Übertragung 1,5 mL der 25 mL Zellkultur zu einem Reaktionsgefäß. Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 1300 xg für 1 Minute bei Raumtemperatur. Diese Zellen sind für die Analyse von Pichia Integranten zu überprüfen, ob das Gen von Interesse in den Pichia-Genom (siehe Schritt II, part2) integriert hat eingesetzt. Bewahren Sie das Zellpellet bei 4 ° C bis zur weiteren Analyse.
- Den Rest der 25 ml-Kultur in einem 50 mL Falcon-Röhrchen und Ernte der Zellen durch Zentrifugation bei 3000 xg für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Dekantieren und legen Sie die Rohre nach oben auf ein Gewebe, um restliche Medien zu entfernen. Zum Waschen das Zellpellet resuspendieren in 20 mL BMMY, um alle verbleibenden BMGY Medium zu entfernen, wie Glycerin aus der BMGY Medium kann die spätere Expression hemmen. Centrifuge wieder bei 3000 xg für 5 Minuten bei Raumtemperatur und Dekantieren des Überstandes.
- Resuspendieren Zellpellet auf eine OD 600 von 1,0 in BMMY Medium zu induzieren Ausdruck (etwa 100-200 ml) und übertragen Sie die Kultur in einem 1-Liter Schikanekolben. Bedecken Sie den Kolben mit 200 mL Becherglas und zum Inkubator zum Wachstum bei 30 ° C weiter
Hinweis: Es ist wichtig, dass die Temperatur nicht über 30 ° C. Wenn die Temperatur Ihres Inkubator schwankt die Temperatur bei 28 ° C. Ausreichende Belüftung ist ebenfalls ein wichtiger Parameter für eine effiziente Expression während der Methanol-Induktion (wenn die Induktion der Expression, nie mehr als eine Kultur Volumen> 10-30% Ihrer gesamten Kolben Volumen). Wir empfehlen die Verwendung von Flaschen verwirrt, da sie mehr Sauerstoff Einführung in die Kultur-Medien. - Add sterilisiert reinem Methanol zu einer Endkonzentration von 0,5% Methanol 24 Stunden auf die Induktion zu erhalten.
- Zu bestimmten Zeitpunkten nach dem Start des Ausdrucks je 1 ml der Kultur in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß. Zentrifuge bei 1300 xg für 2,5 Minuten bei Raumtemperatur. Übertragen Sie den Überstand in eine separate 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Bewahren Sie den Überstand und die Zellpellets bei -80 ° C bis zur weiteren Analyse. Die Proben aus verschiedenen Zeitpunkten werden analysiert, um die optimale Zeit für die Proteinexpression nach Induktion zu etablieren.
Hinweis: wählen wir 6h, 12h, 24h, 36h und 48h als Zeitpunkte für die Aufnahme der Proben. Weiteres Wachstum bis zu 4 Tagen ist möglich. Die optimale Zeitpunkte variieren zwischen den verschiedenen exprimierten Proteine. - Analysieren Sie die Überstände und Zellpellets für die Proteinexpression durch Coomassie-gefärbten SDS-PAGE und Western-Blot (nicht in diesem Protokoll beschrieben).
Teil 2: Hefe DNA-Aufreinigung und PCR-Analyse der Pichia integrant
Alle notwendigen Reagenzien für die Hefe-DNA Aufreinigung Schritt des Pichia Kultur in BMGY sind in der MasterPure Hefe DNA Purification Kit von EPICENTRE enthalten.
Hinweis: Diese Analyse ist eine zusätzliche und wird durchgeführt, um festzustellen, ob das Gen von Interesse in den Pichia-Genom integriert hat. Das Zellpellet aus einem 1,5 mL Probe aus der Kultur in BMGY (siehe Schritt II, Teil 1,3) genommen wird.
Folgen Sie den Anweisungen des Epicentre MasterPure Hefe DNA Purification Handbuch und führen Sie eine PCR mit dem Hefe-DNA mit spezifischen Primern für das Insert. Analysieren 3 ul der PCR-Produkt auf einem Agarosegel mit 1 ul Ethidiumbromid. Fügen Sie eine 1 Kb + Größenmarker in einem gut auf die Größe Ihrer Einlage zu interpretieren und visualisieren die DNA mit einem Gel-Dokumentation entfernt.
Das rekombinante Protein kann durch Western-Blot-Analyse untersucht werden. Proteinreinigung durch His-tag Reinigung von Metall-geladene Harz (noch nicht in diesem Protokoll beschrieben) durchgeführt werden.
Anhang, Liste der Rezepte
Schritt I:
- YPD-Medium:
Zur Vorbereitung 600 mLYPD-Medium (Hefeextrakt-Pepton-Dextrose-Medium) lösen 5 g Hefeextrakt und 12 g Pepton in 540 ml Wasser. Autoklaven für 20 Minuten auf liquide Zyklus.
In der Zwischenzeit bereiten 70 ml 20% Dextrose und vor dem Gebrauch Filter-sterilisiert werden.
Lassen Sie die Lösung autoklaviert cool ~ 60 ° C und 60 ml Filter-sterilisierte 20% Dextrose. - YPDS (+ Zeocin) Platten:
Zu 500 ml YPDS + Zeocin-Agar (Hefeextrakt-Pepton-Dextrose-Medium mit Sorbitol) lösen 5 g Hefe-Extrakt, 91,1 g Sorbit und 10 g Pepton in 450 ml Wasser vorzubereiten. Fügen Sie 10 g Agar und einem magnetischen Rührstab und Autoklaven für 20 Minuten auf liquide Zyklus.
In der Zwischenzeit bereiten 60 ml 20% Dextrose und vor dem Gebrauch Filter-sterilisiert werden.
Lassen Sie die Lösung autoklaviert cool ~ 60 ° C, 50 ml Filter-sterilisierte 20% Dextrose.
Gießen Sie ein paar Teller, bevor Sie das Antibiotikum für YPDS Platten ohne Zeocin. Dann fügen Sie 500 ul Zeocin von einer 100 mg / ml Stammlösung zu einer Endkonzentration von 100 pg / ml Zeocin im Agar zu erhalten. Lassen Sie rühren auf einer magnetischen Platte bei der Zugabe des Antibiotikums und lassen Sie für etwa weitere 2 Minuten gleichmäßig mischen rühren.
Gießen Medien in Petrischalen und Deckel aus schwarzem Kunststoff. Lassen Platten trocken auf der Bank über Nacht. Shop YPD-Platten mit Zeocin bei 4 ° C. Die Haltbarkeit beträgt 1-2 Wochen.
Hinweis: Die Abdeckung mit dem Kunststoff ist notwendig, weil Zeocin ist lichtempfindlich.
Schritt II:
- BMGY (Buffered Glycerol-Komplex Medium) und BMMY (Buffered Methanol-Komplex Medium):
Lösen Sie für jedes Medium 8 g Hefeextrakt und 16 g Pepton in 560 ml Wasser. Autoklaven für 20 Minuten auf liquide Zyklus.
In der Zwischenzeit bereiten die folgenden Lösungen:- 1 M Kaliumphosphatpuffer, pH 6,0:
- 10X YNB (13,4% Yeast Nitrogen Base mit Ammoniumsulfat ohne Aminosäuren):
- 500X B (0,02% Biotin):
- 10X M (5% Methanol):
- 10X GY (10% Glycerin):
Lassen Sie die Lösung autoklaviert auf Raumtemperatur abkühlen, dann fügen Sie die folgende und gut mischen:- 80 mL 1 M Kaliumphosphatpuffer, pH 6,0;
- 80 mL 10X YNB
- 0,16 ml 500X B
- 80 mL 10X GY
Bewahren Sie die Medien bei 4 ° C. Die Haltbarkeit dieser Lösung ist, etwa zwei Monate.
Repräsentative Ergebnisse
Abbildung 1. Das Western-Blot-Bild zeigt vier exprimierten Proteine (bezeichnet als 1605, 0537, 1228 und 1682) nach 24 Stunden des Ausdrucks. Der Antikörper für Immunoblots wurde eine c-myc-HRP Antikörper. Die zweite Spur (mit der Bezeichnung N) ist eine Negativ-Kontrolle und wurde mit Überstand von Zellen, die nicht exprimieren ein rekombinantes Protein geladen werden, weil sie mit den Eltern (plain) transformiert wurden.
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Discussion
Proteinexpression mit der methylotrophen Hefe Pichia pastoris als Host-System wird in diesem Protokoll beschrieben. Das Protein kann in das Medium in Abhängigkeit der verwendeten Klonierungsvektor sezerniert werden. Die Sekretion des rekombinanten Proteins ist die anschließende Reinigung zu erleichtern. Allerdings können die gezeigten Bedingungen müssen für die Expression verschiedener Proteine und Änderungen in den Bedingungen und Ausdruck optimiert werden, kann zu erhöhten Protein-Ebene führen. Der Vektor in diesem Protokoll hat die Funktion eines c-myc-Epitop und einem Antikörper für dieses Epitop erworben werden kann. Dies ermöglicht die Analyse von Proteinen, für die es keine Antikörper noch nicht verfügbar. Die His-Tag-Funktion des übergeordneten Vektor erleichtert die Reinigung von Proteinen auf Metall-Chelat-Harz und dort ist auch ein Antikörper für die His-Tag-Abschnitt des Vektors zur Verfügung.
Wie in diesem Protokoll beschrieben, ist die Proteinexpression in Pichia pastoris ein mehrstufiger-Prozess, der gut geplant und vorbereitet braucht. Eine Zeit von zwei vor drei Wochen erforderlich, um alle Schritte durchzuführen, aber ohne die Klonierung des Konstrukts mit dem Gen von Interesse. Die Basis für eine erfolgreiche Transformation in P. pastoris sind hoch effiziente Transformation kompetenter Hefezellen und eine linearisierte Konstrukt, das in der Hefe-Genom integrieren können. Western-Blot-Analyse und His-tag Reinigung sind Anwendungen auf das Niveau der Expression rekombinanter Proteine zu bestimmen und sind die nächsten Schritte nach diesem Protokoll durchzuführen.
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Acknowledgments
Wir möchten den kanadischen Stiftung für Innovation, der British Columbia Knowledge Development Fund und der Canadian Institutes of Health Research (CIHR) für die Unterstützung dieser Arbeit danken. MT wurde durch ein Stipendium von der Stiftung finanziert TULA Zentrum für Mikrobielle Vielfalt und Evolution (CMDE) unterstützt.
References
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- Cregg, J. M., Barringer, K. J., Hessler, A. Y. Pichia pastoris as a Host System for Transformations. Mol. Cell. Biol. 5, 3376-3385 (1985).
- Cregg, J. M., Cereghino, J. L., Shi, J., Higgins, D. R. Recombinant protein expression in Pichia pastoris. Mol Biotechnol. 16, 23-52 (2000).
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