Измерение 50% Гемолитическая Дополнение (CH ₅₀) Активность сыворотки

Summary

Классический путь активируется антител и достигает высшей точки в целевую лизис клетки. CH

Abstract

Системы комплемента представляет собой группу белков, которые при активации приводит к лизису клетки-мишени и облегчает фагоцитоз через opsonisation. Отдельные компоненты дополнения могут быть количественно однако это не дает никакой информации о деятельности путем. CH

Protocol

Подготовка 5x веронал буферного раствора (VBS)

1. Для подготовки веронал буферного раствора (VBS), три отдельных решения должны быть подготовлены.
2. Подготовка раствора 1, растворяя 21.25gm из NaCl и 0.94gm натрия Barbitone в 350 мл дистиллированной воды. Конечные концентрации NaCl и натрия Barbitone являются 1.02M и 13 мм соответственно.
3. Подготовка раствора 2, растворяя 1.44gm из Barbitone в 125 мл горячей дистиллированной воды. Конечная концентрация Barbitone является 62.5mM.
4. Подготовка раствора 3, растворяя 20.33gm из MgCl ₂ и 4.41gm из CaCl ₂ в 100 мл дистиллированной воды. Конечной концентрации MgCl ₂ и CaCl _2, 2.18M и 440мм соответственно.
5. Смешайте растворы 1 и 2 и охладить до комнатной температуры.
6. После совместного решения остынет, добавить 1.25ml решения 3 и регулировать рН до 7.3-7.5 использованием 1М HCl.
7. Отрегулируйте конечного объема 500 мл дистиллированной воды для приготовления 5x маточного раствора.
8. Для подготовки 1x рабочий раствор, развести акции 1:05 дистиллированной водой.

Сенсибилизация из эритроцитов барана с гемолизин

1. Подготовка гемолизин по во-первых разбавления 1:50 с VBS
2. Для 4 мл ЭБ добавить 6 мл на VBS и осторожно перемешайте инверсии
3. Центрифуга на 600 г х 5 минут
4. Удалите супернатант и промыть клетки еще 2 раза
5. После последней промывки, центрифуги клеток в 900 г 5 минут х упаковать клетки
6. Удалите супернатант и ресуспендирования клеток в достаточном VBS подготовить 10% раствор, т.е. 0,5 мл упакованных клеток ресуспендируют в 5 мл буфера
7. По каплям добавить равный объем гемолизин (кролик против овец красный антитела клеток крови) для клеток, закрученной непрерывно
8. Инкубировать при температуре 30 ° С в течение 30 минут на водяной бане
9. Аккуратно перемешайте клетки каждые 15 минут
10. Sensitised ЭБ, могут храниться в течение ночи при 4 ° С

CH ₅₀ анализа

1. Этикетка ряд труб в двух экземплярах с 1:08, 1:16, 1:32, 1:64 и 1:128.
2. Приготовьте серию в два раза серийных разведений контрольных и испытательных сыворотки в VBS каждый в двух экземплярах
3. Начало в 1:04 (100 мл сыворотки + 300 мл VBS) и передачу 200 мл образца в следующем помечены трубки.
4. Тщательно перемешать между разведения и передачи 200мл к следующему разбавления свежей кончика пипетки.
5. Повторяйте, пока все пять разведения делаются.
6. Отменить 200мл от окончательного 1:128 разбавления.
7. Добавить 200 мл приостановлено сенсибилизированных ЭБ во все пробирки.
8. Этикетка два отдельных труб как пустые и добавьте 200 мл сенсибилизированных ЭБ + 200 мл VBS. Эти трубки будут измерять спонтанного лизиса ЭБ в VBS.
9. Этикетка еще две отдельные трубы, ОБЩАЯ лизиса и добавить 200 мл сенсибилизированных ЭБ + 200 мл дистиллированной воды.
10. Аккуратно перемешайте все пробирки.
11. Инкубировать при 37 ° С в течение 30 минут в водяной бане смешивания через 15 минут.
12. Центрифуга образцов при 1500 г в течение 5 минут, чтобы осадок эритроцитов.
13. Передача 100 мл супернатант из каждой пробирки, чтобы хорошо в 96-плоским дном тарелку.
14. Добавить 100 мл дистиллированной воды в каждую лунку.
15. Измерить абсорбцию образцов при 540нм использованием пластины спектрофотометр.

Расчеты

1. Рассчитать среднюю оптическую плотность каждого образца
2. Вычтите BLANK абсорбции (спонтанного лизиса) из всех образцов
3. Рассчитать% лизис для каждого разведения по следующей формуле:
   
4. Участок процент лизиса (вертикальная ось) в зависимости от разведения сывороток на горизонтальной оси.
5. Расчет разбавления требуется на 50% гемолизу для контроля и испытания сыворотки (рис. 2).

Представитель Результаты:

Видео включает в себя пример представителя результаты. На практике контроль сыворотки также запустить в то же время в качестве тест-сыворотки и рассматривается в том же порядке. Ниже (табл. 1) приведен пример данных из протестированных образцов сыворотки. Данные манипуляции в соответствии с уравнением, представленные в 5,3.

Образец	OD 540	Среднее
Пустой	0,042, 0,044	0,043
Всего лизис	0,183, 0,183	0,183
	OD 540	Среднее	Средние и Бланк	% Лизис
1:08	0,200, 0,219	0,210	0,168	116
1:16	0,179, 0,173	0,176	0,134	93
1:32	0,134, 0,110	0,122	0,08	55
1:64	0,053, 0,066	0,059	0,017	12
1:128	0,044, 0,045	0,045	0,003	2

Рисунок 1. Активация классического пути комплемента. Классический путь активируется путем связывания иммуноглобулина M (IgM) или иммуноглобулин G (IgG) на поверхности клетки-мишени. Fc части Ab связывается с C1q, C1R будет активирована, и это в свою очередь, активирует другой молекулой C1R которые вместе активирует две молекулы C1s. C1s теперь расщепляет С4, который предоставляет сайт связывания С2, который также расщепляется. Связывание C4b и C2a приводит к образованию комплекса называют конвертазы С3. Этот комплекс теперь расщепляет C3 формирования C3a и C3b, некоторые из которых в сочетании с конвертазы C3 формирования конвертазы C5. Этот комплекс в настоящее время действует на С5, с результатом C5b привязки к C6 начало образованию комплекса мембранной атаки (MAC). C5b6 действует на C7, который в свою очередь воздействуют на С8 и в конечном счете на C9 в результате формирования окончательной MAC. (Goldsby и др., 2003).

Рисунок 2. Построение выборки данных и расчета CH50 для контроля и испытания образцов сыворотки. (А), рассчитанный в процентах (%) лизис и управления (•) и тест () образцах сыворотки показаны в зависимости от разбавления фактор. (Б) Для расчета 50% лизиса, линия рисуется от 50% процентов значения, до пересечения с графиком линии, а затем вертикальная линия до разбавления. В этом примере 35-кратного разбавления контроля и 21,6 раза разведения теста сыворотки, необходимой для достижения 50% лизиса. Эти данные показывают, что там меньше дополнением присутствуют в сыворотке тест по сравнению с контролем, как это требуется меньше разбавление до 50% лизиса была достигнута. Контрольная проба также показывает,> 100% лизиса в разведении 1:8. Скорее всего, это из-за неполного лизиса ЭБ на дистиллированную воду и более эффективное лизис компонентов комплемента.

Discussion

CH ₅₀ анализа подлежит много помех. Некоторые ЭБ более хрупки, чем другие, в результате спонтанного гемолиза, что не имеет отношения к дополнять деятельность. Сродство антител кролика варьируется от партии к партии и от одного производителя к другому, это влияет на количество антител, которые связываются с ЭБ. Кроме того, процесс информирования ЭБ с антителами приводит к клеткам с разным количеством антител покрытие ЭБ. Сбор и хранение образцов являются важным потенциальным источником ошибок. Компонентов комплемента например C1q, C3, C4 и C5 чрезвычайно лабильны, поэтому надлежащим образцом обработки имеет решающее значение. Длительное воздействие тепла снизится дополнять деятельность и будет производить неактивные фрагменты компонентов комплемента. Чтобы определить, как многие источники ошибок, как это возможно, имеет решающее значение для проверки контрольной сыворотки с известным CH ₅₀ значение каждый раз, когда анализ проводится и воспроизводить принято значение известно контрольной сыворотки. Один из способов определить, если Есть ли различия между различными партиями и ЭБ гемолизин том, чтобы проверить новые тестовые материалы против стандартного образца сыворотки несколько раз, и затем определить, если Есть любые изменения в базального уровня гемолиза или CH ₅₀ значение для контрольной сыворотки.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sheep red blood cells	CSL	2490201	Use at 1% final
Serum			Human serum
Rabbit Anti-Sheep Haemolytic serum (RBCs), Unconjugated	AbD Serotec	C12HSB
96 well flat bottom plate	Sarstedt Ltd	83.1839
Veronal buffered saline			Use at 1x final
Waterbath
Plate reader
37°C room/incubator