Summary
לבסס מודל כרוני חיידקי עכבר נגוע מתמיד
Abstract
המודל חיידקי עכבר נגוע היא מערכת מודל רב עוצמה ללימוד בתחומים כגון דלקת זיהום, אימונולוגיה, התמרה האות, ו tumorigenesis. חוקרים רבים ניצלו קוליטיס המושרה על ידי
Protocol
פרוטוקול זה כולל שלושה חלקים: זיהוי תרבית החיידקים gavage העכבר, סלמונלה.
1. הצמיחה סלמונלה מצב.
- הכן את סלמונלה לוריא-Bertani מרק (LB) צלחת, דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- בחר שיבוט מהצלחת LB והכניסו LB 7 מ"ל בצינור 12 מ"ל, וללחוץ על 37 מעלות צלזיוס למשך כ 5 שעות.
- לחסן 50 מ"ל LB עם 0.05 מ"ל של תרבות שלב דגירה נייחים ב 37 ° C בלי לרעוד במשך כ 18 שעות.
- ספין תרבית החיידקים למשך הלילה בטמפרטורת החדר עם 6000 סל"ד במשך 10 דקות, להשעות את החיידקים באמצעות HBSS 100:3 יחס (LB: HBSS). לדוגמה:
בכל תרבות LB 50 מ"ל יושעה ב 1.5 HBSS מ"ל. - עבור gavage החי, עוד למהול את תרבית החיידקים ביחס 1:10. לדוגמה:
1.5 כל LB תרבות מ"ל יושעה ב 15 HBSS מ"ל.
2. סלמונלה, זיהום מודל *.
- הכן את הפתרון סטרפטומיצין. עכבר כל תינתן 7.5 מ"ג של סטרפטומיצין ב 100 HBSS μl. לדוגמה, להכין סך 90 מ"ג של סטרפטומיצין ב 1.2 HBSS מ"ל במשך 10 עכברים. תמיד יש תוספת נפח כשמכינים את הפתרון סטרפטומיצין.
- משיכה מים ומזון 4 שעות לפני הטיפול gavage הפה.
- עכברים Gavage עם סטרפטומיצין עם 7.5 מ"ג של סטרפטומיצין (100 μl של HBSS עבור עכברים שליטה). תפוס את העור מעל הכתף עכבר בחוזקה עם האגודל והאצבע האמצעית, למתוח את הראש והצוואר עם האצבע על מנת להפוך את הוושט ישר. כוונו את הכדור קצה המחט האכלה לאורך הגג של הפה כלפי הצד הימני האחורי של הלוע, אז בעדינות לעבור לתוך הוושט להזריק את הפתרון 100 μl. ההתנגדות לא צריכה להיות מורגשת.
- בגיל 20 שעות לאחר הטיפול סטרפטומיצין, מים ומזון נסוגה שוב לפני עכברים נגועים בחיידקים.
- Gavage כל עכבר עם ההשעיה 100 μl ב HBSS או שטופלו HBSS סטרילי (שליטה) על ידי gavage הפה. ההליך gavage זהה 2.3) עכברים gavage עם סטרפטומיצין.
* ניסויים בבעלי חיים בוצעו על ידי שימוש ספציפי-הפתוגן ללא C57BL נקבה / 6 עכברים (Taconic, הדסון, ניו יורק) שהיו 6-7 שבועות כפי שתואר לעיל 1. פרוטוקול שאושר על ידי האוניברסיטה של אוניברסיטת רוצ'סטר ועדת משאבים בעלי חיים (UCAR).
3. איתור של סלמונלה במעי.
- עכבר איסוף צואה (כ 100 מ"ג).
- העברת דגימת צואה על צינור 1.5 צנטריפוגה מיקרו עם 1ml PBS ו מערבולת במרץ.
- צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 800 סל"ד. מעבירים את supernatant לתוך צינור microfuge נקי.
- צנטריפוגה בסל"ד 6000 עבור 5min. Supernatant נמחקת ו 200 PBS μL הוא הוסיף את כדורי ואת vortexed.
- Streak 200 PBS μl עם מפזר תא הפנויה על צלחת CHROMagar BBL לזהות סלמונלה. סלמונלה מינים מופיעים ארגמן (עלה סגול, ראה תמונה 1). אם התשואות 200 μl מושבות רבות מדי על הצלחת, או להשתמש 100 μl 50 μl עבור פס.
4. נציג תוצאות.
כאשר הפרוטוקול הוא נעשה בצורה נכונה, קולוניזציה typhimurium סלמונלה ניתן להבחין במעי העכבר מעל 6 חודשים. סלמונלה יכול להיות מזוהים על ידי תרבות צואה מעל 6 חודשים (תמונה 1). בתור החוצה טיפוסי לבוא של מודל זה, הגוף שוקל אובדן ומוות להתרחש בתוך 4 שבועות זיהום הודעה. תלוי זני סלמונלה המשמש זיהום, עכברים מסוימים עשויים לא לשרוד מעל 6 חודשים.
באיור 1. סלמונלה מעיים של סלמונלה מינים מופיעים ארגמן (עלה סגול) בצבע, עקב הבדלים מטבוליים בנוכחות chromogens שנבחר. חיידקים אחרים הם או עכבות או לייצר מושבות כחול ירוק או צבע.
איור 2. הפרופורציות ההישרדות של עכברים נגועים עם מוטציה זן סלמונלה PhoP ג, ג PhoP אברה-ו PhoP ג AvrA-/AvrA +, PhoP ג אברה למשך 4 שבועות (28 ימים).
1. טבלת משקל גוף של עכברים נגועים עם סלמונלה למשך 4 שבועות.
| 0 | 1 שבוע | 2 שבועות | 3 שבועות | 4 בשבוע | |
| שליטה | 16.78 ± 1.05 | 16.91 ± 1.28 | 18.26 ± 1.23 | 19.31 ± 1.26 | 20.26 ± 1.15 |
| PhoP ג 16.89 ± 1.03 | 17.14 ± 1.19 | 17.43 ± 1.63 * | 18.68 ± 1.78 | 20.05 ± 1.11 | |
| PhoP c-אברה | 16.91 ± 1.12 | 16.96 ± 1.39 | 17.06 ± 2.14 ** | 18.71 ± 2.18 | 20.15 ± 1.56 |
| PhoP ג AvrA-/AvrA + | 16.94 ± 0.96 | 17.17 ± 1.02 | 17.63 ± 1.42 * | 18.44 ± 2.03 | 20.09 ± 1.17 |
* לעומת קבוצת הביקורת p <0.05
** לעומת קבוצת הביקורת p <0.01
טבלה 2. זני סלמונלה השתמשו במחקר זה.
| שם | תאור | הפניה או מקור |
| סלמונלה 14028s | Wild מסוג S. typhimurium | ATCC |
| PhoP ג | Non-פתוגניים הרגולטור מורכב מוטציה | מילר et al. 1990 |
| PhoP c-אברה | אברה-מוטציה | קולייר-היינס et al. 2002 |
| PhoP ג AvrA-/AvrA + | PhoP ג אברה, אברה השלים עם קידוד פלסמיד | קולייר-היינס et al. 2002 |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כדי להשתמש במערכת, זה הכרחי עבור החוקר ללמוד איך gavage החיות. אנו פרט מתודולוגיה להכין התרבות חיידקים gavage העכברים. כמו כן, אנו מראים כיצד לפקח על התמדה סלמונלה בדרכי (GI) במערכת העיכול. השלבים הקריטיים פרוטוקול זה כולל:
- סטרפטומיצין, המקדים: סטרפטומיצין, טיפול מקדים יכול להיפטר כמה צמחיית המעיים commensal ולעשות את העכברים רגישים לזיהום סלמונלה 2.
- סלמונלה gavage: למתחילים, gavage יכול להיות מאתגר. מתישהו, gavage נכשל כי הפתרון מוזרק בטעות בדרכי הנשימה וגורם למוות העכבר.
- קולוניזציה חיידקית מתמיד: צריך לסגור ניטור חיידקים במערכת העיכול. בנוסף לתרבות עכבר צואה, תוכן cecum יכול לשמש גם לגילוי סלמונלה צלחות BBL CHROMagar. איסוף תכנים cecum כאשר העכברים מוקרבים לאחר זיהום סלמונלה.
בדקנו את הקולוניזציה סלמונלה העכבר בריכוזים שונים: 1 x 10 3 מושבה יוצרי יחידות 1 x 10 8 המושבה להרכיב יחידות (100 μl / עכבר). בשלב 1 x 06-10 אוקטובר 10 x 8 המושבה להרכיב יחידות, סלמונלה הצליח ליישב את העכברים. לכן, בהתבסס על פרסומים קודמים שלנו 1, 5 ו - נתונים שלא פורסמו, הריכוז הסופי של סלמונלה פתרון זה לא תימדד לפני gavage.
בהליך זה ניסיוני, השתמשנו ספציפי-הפתוגן ללא C57BL נקבה / 6 עכברים (Taconic, הדסון, ניו יורק) שהיו 6-7 שבועות. זני חיידקים המשמשים כוללות typhimurium סלמונלה wild-type זן ATCC14028s (WT-SL), פתוגניים שאינם מוטציה זן סלמונלה PhoP C3, PhoP ג אברה-ו PhoP ג AvrA-/AvrA +, PhoP ג אברה (לוח 2). באמצעות פרוטוקול זה, קולוניזציה סלמונלה typhimurium ניתן להבחין במעי העכבר מעל 6 חודשים (Fig1). לזיהום סלמונלה ודלקת נמדדו על ידי התבוננות צואה ומשקל הילד. כאשר דגימות רקמה דם נאספו, אורך המעי נמדדה כתכונה של דלקת מעיים. משקולות של spleens ואת הכבדים נבדקו גם. עכבר ציטוקינים בדם נבדקו על ידי ELISA5. שיטות עוד יותר, ביוכימיות מולקולרית משמשים נוספת כדי לבדוק את השינויים של ציטוקינים דלקתיים שינויים הפתולוגיה המושרה על ידי סלמונלה 5.
בדרך כלל, משקל גוף אובדן ומוות להתרחש בתוך 4 שבועות זיהום הודעה (טבלה 1). הודעה על זיהום סלמונלה, היה אובדן משמעותי במשקל הגוף בקבוצות נגוע חיידקים בהשוואה לקבוצת הביקורת ללא טיפול חיידקי (* p <0.05 או p <0.001 טבלה 1). משקל הגוף נמדדה שבועי. הפרופורציות הישרדות 4 שבועות זיהום שלאחר היו באיור. 2. בסך הכל, 92% של עכברים (n = 50) נגועים עם זנים סלמונלה PhoP ג, 78% PhoP ג אברה, או 70% PhoP ג AvrA-/AvrA + יכול לשרוד עם סלמונלה מתמשך במעי. לאחר דלקת חריפה, ניצולי כל עוד נשא סלמונלה, אשר ניתן היה לזהות זיהום שלאחר 6 חודשים בשיטה המתוארת בהצעה זו. לאחר עכברים לשרוד 3 שבועות זיהום לפרסם, עכברים במשקל הגוף ומוות התרחשו פחות (Fig.2). יתר על כן, מכתים נתונים immunofluroscence גם להראות את הפלישה של סלמונלה המעי דלקת רירית 27 שבועות פוסט (Fig.3). נתונים אלו הראו כי PhoP ג, ג PhoP אברה, או PhoP ג AvrA-/AvrA + יכול לשמש מודל זיהום כרוני.
עכברים עם גורם מארח התנגדות Nramp1 + / + הם עמידים בפני זיהום סלמונלה 3-6. C57/BL6 עכברים עם Nramp היו פגומים להשתמש במחקרים הנוכחי. מצאנו כי 90% עכברים נגועים 14028s פתוגניים זן סלמונלה לא יכולים לשרוד מעל 4 שבועות (מידע לא מוצג). כדי להבין את ההשפעות ארוכות הטווח של זיהום wild-type Typhimurium ס, בעכברים עם Nampr1 / + + יכול לשמש.
מודל זה היא הוקמה בשנת מעבדה BSL-2. פרוטוקול שלנו היא אושרה על ידי האוניברסיטה של אוניברסיטת רוצ'סטר ועדת משאבים בעלי חיים (UCAR). עכברים שהודבקו סלמונלה נוטות לסבול אי נוחות ומצוקה ולהיות פעיל פחות לנוע לאט. הפרווה שלהם יכולה להיות פרועות, הם לא יכולים להאכיל או לשתות כרגיל. בעלי חיים יהיה לצפות מקרוב אם שום סימן של אי נוחות כגון יכולת ambulate מספיק טוב כדי לשמור על הלחות ועל צריכת הקלוריות אם העכבר הראה סימן לכך היה aspirated נוזל או גוף משמעותית במשקל (10% או יותר) 7, ועשה לא למות מיד, העכבר היה מורדמים אנושי. כל אנשי המעבדה יוכשרוהתבוננות עכברים כראוי 8, 9.
מחקרים רבים השתמשו סטרפטומיצין-המקדים ניצלו קוליטיס המושרה על ידי typhimurium סלמונלה עבור מחקרים בשלב מוקדם של זיהום 1,2,10. עם זאת, רק מעטים מדווחים על זיהום כרוני במודל עכבר in vivo 11. עכברים עם סלמונלה קיום מתמשך במערכת העיכול מאפשרים לנו לחקור את המארחת בקטריאלי לטווח ארוך אינטראקציה, התמרה האות, ו tumorigenesis. הקמנו מודל כרוני חיידקי עכבר נגוע קולוניזציה סלמונלה typhimurium במעי העכבר מעל 6 חודשים. מודל זה יכול לשמש גם עבור בפתוגנזה E.coli ומחקרים פרוביוטיקה. בסך הכל, פרוטוקול זה יסייע לחוקרים באמצעות מודל העכבר כדי לענות על שאלות ביולוגיות מיקרוביולוגית חשוב ביסודו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי KO1 NIDDK DK075386 מענק האגודה האמריקנית למלחמה בסרטן RSG-09-075-01-MBC עד יוני יום ראשון
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS | Sigma-Aldrich | ABCD1234 | |
| Luria-Bertani broth | BD Biosciences | 244610 | |
| Feeding needle | Popper & Sons, Inc. | 7920 | |
| Streptomycin | MP Biomedicals | 100556 | |
| BBL CHROMagar Salmonella | BD Biosciences | 214983 | |
| Disposable cell spreaders | Biologix Research Company | 65-1010 |
References
- Duan, Y. beta-Catenin activity negatively regulates bacteria-induced inflammation. Lab Invest. 87 (6), 613-624 (2007).
- Barthel, M. Pretreatment of mice with streptomycin provides a Salmonella enterica serovar Typhimurium colitis model that allows analysis of both pathogen and host. Infection and immunity. 71 (5), 2839-2858 (2003).
- Miller, S. I., Mekalanos, J. J. Constitutive expression of the phoP regulon attenuates Salmonella virulence and survival within macrophages. Journal of bacteriology. 172 (5), 2485-2490 (1990).
- Valdez, Y. Nramp1 expression by dendritic cells modulates inflammatory responses during Salmonella Typhimurium infection. Cell Microbiol. 10 (8), 1646-1661 (2008).
- Woo, H., Okamoto, S., Guiney, D., Gunn, J. S., Fierer, J. A model of Salmonella colitis with features of diarrhea in SLC11A1 wild-type mice. PLoS ONE. 3 (2), e1603-e1603 (2008).
- Dangl, J. L. Molecular call-and-response: how Salmonella learns the gospel from its host. Trends Microbiol. 11 (6), 245-246 (2003).
- Zaharik, M. L., Vallance, B. A., Puente, J. L., Gros, P., Finlay, B. B. Host-pathogen interactions: Host resistance factor Nramp1 up-regulates the expression of Salmonella pathogenicity island-2 virulence genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 15705-15710 (2002).
- Townsend, P., Morton, D. B. Laboratory Animal Care Policies and Regulations: United Kingdom. ILAR J. 37 (2), 68-74 (1995).
- Olfert, E. D., Godson, D. L. Humane endpoints for infectious disease animal models. ILAR J. 41 (2), 99-104 (2000).
- Ye, Z., Petrof, E. O., Boone, D., Claud, E. C., Sun, J. Salmonella effector AvrA regulation of colonic epithelial cell inflammation by deubiquitination. Am J Pathol. 171 (3), 882-892 (2007).
- Grassl, G. A., Valdez, Y., Bergstrom, K. S., Vallance, B. A., Finlay, B. B. Chronic enteric salmonella infection in mice leads to severe and persiste nt intestinal fibrosis. Gastroenterology. 134 (3), 768-780 (2008).
- Sukupolvi, S., Edelstein, A., Rhen, M., Normark, S. J., Pfeifer, J. D. Development of a murine model of chronic Salmonella infection. Infection and immunity. 65 (2), 838-842 (1997).
- Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). , Fifth Edition, US Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention and National Institutes of Health. (2007).
- Wu, S., Lu, R., Zhang, Y., Sun, J. Chronic effects of a Salmonella type III secretion effector protein AvrA in vivo. PLoS ONE. , Forthcoming (2010).
