Summary
Upprätta en kronisk bakteriell infekterad musmodell med ihållande
Abstract
Den bakterie infekterade musmodell är ett kraftfullt modellsystem för att studera områden som infektion, inflammation, immunologi, signaltransduktion, och Tumörgenesens. Många forskare har dragit nytta av kolit inducerad av
Protocol
Detta protokoll innehåller tre delar: bakteriekultur, mus sondmatning, och Salmonella upptäckt.
1. Salmonella tillväxt skick.
- Förbered Salmonella Luria-Bertani buljong (LB) agar, inkubera vid 37 ° C över natten.
- Välj en klon från LB plattan och tas i 7 ml LB i en 12 ml tub, och skaka vid 37 ° C i ca 5 timmar.
- Inokulera 50 ml LB med 0,05 ml av en stationär fas kultur och inkubera vid 37 ° C utan att skaka i ca 18 timmar.
- Spin natten bakterieodling vid rumstemperatur med 6000 rpm i 10 minuter, dra in bakterier i HBSS med förhållandet 100:3 (LB: HBSS). Till exempel:
Varje 50 ml LB kulturen kommer att skjutas upp i 1,5 ml HBSS. - För djuret sondmatning, ytterligare späda bakterieodling vid 1:10 förhållandet. Till exempel:
Varje 1,5 ml LB kulturen kommer att skjutas upp i 15 ml HBSS.
2. Salmonella-infektion modell *.
- Förbered streptomycin lösningen. Varje mus kommer att få 7,5 mg av streptomycin i 100 l HBSS. Till exempel förbereda totalt 90 mg av streptomycin i 1,2 ml HBSS för 10 möss. Ha alltid lite extra volym vid upprättandet av streptomycin lösningen.
- Dra vatten och mat 4 timmar innan oral sondmatning behandling.
- Sondmatning möss med streptomycin med 7,5 mg av streptomycin (100 ìl HBSS för kontroll möss). Ta tag i huden över musen axeln ordentligt med tummen och långfingret, sträcka huvudet och halsen med pekfingret för att göra i matstrupe rak. Direkt bollen-tip för utfodring nålen längs gommen och mot höger sida av ryggen i svalget, sedan försiktigt passera ner i matstrupen och injicera 100 l lösning. Inget motstånd ska kännas.
- Vid 20 timmar efter streptomycin behandling, tillbaka vatten och mat igen innan möss infekterade med bakterier.
- Sondmatning varje mus med 100 l suspension i HBSS eller behandlas med steril HBSS (kontroll) via oral sondmatning. Det sondmatning Förfarandet är detsamma som 2,3) sondmatning möss med streptomycin.
* Djurförsök utfördes genom att använda särskilda-patogenfria hona C57BL / 6 möss (Taconic, Hudson, NY) som var 6-7 veckor gamla som tidigare beskrivits 1. Protokollet godkändes av University of Rochester University kommittén för djurs Resurser (UCAR).
3. Detektion av Salmonella i tarmen.
- Samla mus fekal (ca 100 mg).
- Överföring fekal prov till en 1,5 mikro centrifugrör med 1 ml PBS och vortexa kraftigt.
- Centrifugera 10 min vid 800 rpm. Överför supernatanten i ett rent mikrofugrör.
- Centrifugering vid 6000 rpm för 5min. Supernatanten tas bort och 200 mikroliter PBS läggs till pellets och vortexed.
- Utstryk med 200 l PBS med en disponibel cell spridare på en BBL CHROMagar platta att upptäcka salmonella. Salmonella arter visas lila (steg till lila, se Fig.1). Om 200 l ger för många kolonier på plattan, använd 100 l eller 50 l för strimma.
4. Representativa resultat.
När protokollet är gjort på rätt sätt, kan Salmonella typhimurium kolonisering påvisas i musen tarmen över 6 månader. Kunde ha upptäckts av fekal kultur över 6 månader (figur 1) Salmonella. Som en typisk ut kommer av denna modell, kropp väger förlust och död inträffar inom 4 veckor efter infektion. Beroende på Salmonella-stammar används för infektion, kan vissa möss överleva utan över 6 månader.
Figur 1. Intestinal Salmonella i Salmonella arter visas lila (steg till lila) i färg, på grund av metaboliska skillnader i närvaro av utvalda kromogener. Andra bakterier är antingen hämmas eller producera blå-grön eller färglösa kolonier.
Figur 2. Survival proportioner möss infekterade med Salmonella mutant stam PhoP c, PhoP c Avra-och PhoP C AvrA-/AvrA +, PhoP c Avra i 4 veckor (28 dagar).
Tabell 1. Kroppsvikt av möss infekterade med Salmonella i 4 veckor.
| 0 | 1 vecka | 2 veckor | 3 veckor | 4 veckor | |
| kontroll | 16,78 ± 1,05 | 16,91 ± 1,28 | 18,26 ± 1,23 | 19,31 ± 1,26 | 20,26 ± 1,15 |
| PhoP C 16,89 ± 1,03 | 17,14 ± 1,19 | 17,43 ± 1,63 * | 18,68 ± 1,78 | 20,05 ± 1,11 | |
| PhoP c Avra- | 16,91 ± 1,12 | 16,96 ± 1,39 | 17,06 ± 2,14 ** | 18,71 ± 2,18 | 20,15 ± 1,56 |
| PhoP c AvrA-/AvrA + | 16,94 ± 0,96 | 17,17 ± 1,02 | 17,63 ± 1,42 * | 18,44 ± 2,03 | 20,09 ± 1,17 |
* Jämfört med kontrollgruppen p <0,05
** Jämfört med kontrollgruppen p <0,01
Tabell 2. Salmonella-stammar som används i denna studie.
| Namn | Beskrivning | Referens eller källa |
| Salmonella 14028s | Vildtyp S. typhimurium | ATCC |
| PhoP C | Icke-patogena komplex regulator mutant | Miller et al. 1990 |
| PhoP c Avra- | Avra-mutation | Collier-Hyams et al. 2002 |
| PhoP c AvrA-/AvrA + | PhoP c Avra-med kompletterat plasmid-kodning Avra | Collier-Hyams et al. 2002 |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
För att använda detta system är det nödvändigt för forskaren att lära sig att sondmatning djuren. Vi detalj en metod för att förbereda bakteriekultur och sondmatning till möss. Vi visar också hur man kan övervaka Salmonella persistens i gastrointestinal (GI) tarmkanalen. Den kritiska steg i detta protokoll, inklusive:
- Streptomycin-förbehandling: streptomycin-förbehandling kan bli av med några kommensala tarmflora och göra möss mottagliga för salmonella infektion 2.
- Salmonella sondmatning: för nybörjaren kan sondmatning vara utmanande. Ibland misslyckas sondmatning eftersom lösningen av misstag injiceras i luftvägarna och orsakar musen död.
- Ihållande bakteriell kolonisering: behöver noggrann övervakning bakterier i mag-tarmkanalen. Förutom att musen fekal kultur, kan innehållet i blindtarmen också användas för Salmonella upptäckt i BBL CHROMagar plattor. Samla blindtarmen innehåll när möss offras efter salmonella infektion.
Vi har testat Salmonella koloniseringen hos mus vid olika koncentrationer: 1 x 10 3 kolonibildande enheter till 1 x 10 8 kolonibildande enheter (100 l / mus). Vid 1 x 10 6 till 10 x 10 8 kolonibildande enheter, var Salmonella kan kolonisera möss. Därför, baserat på våra tidigare publikationer 1, 5 och opublicerade data kommer den slutliga koncentrationen av Salmonella i denna lösning inte mätas innan sondmatning.
I denna experimentella procedur använde vi specifika-patogenfria hona C57BL / 6 möss (Taconic, Hudson, NY) som var 6-7 veckor gamla. Bakteriell används stammar inkluderar Salmonella typhimurium vildtyp stam ATCC14028s (WT-SL), icke-patogena Salmonella mutant stam PhoP c3, PhoP c Avra-och PhoP C AvrA-/AvrA +, PhoP c Avra (tabell 2). Med hjälp av detta protokoll, kan Salmonella typhimurium kolonisering påvisas i musen tarmen över 6 månader (Fig 1). Salmonella infektion och inflammation mättes genom att observera avföring och pojke vikt. När vävnadsprover och blod samlades in, var längden på tarmen mätt som en funktion av intestinal inflammation. Vikterna av mjälte och lever undersöktes också. Mus serum cytokin testades av ELISA5. Vidare, biokemiska och molekylära metoder är ytterligare används för att testa de förändringar av inflammatoriska cytokiner och patologi förändringar som Salmonella 5.
Typiskt, viktnedgång och död inträffar inom 4 veckor efter infektion (tabell 1). Inlägg salmonellainfektion, det fanns betydande viktminskning i den bakteriella infekterade grupperna jämfört med kontrollgruppen utan bakteriell behandling (* p <0,05 eller p <0,001 tabell 1). Kroppsvikt mättes varje vecka. Överlevnaden proportioner 4 veckor efter infektion visades i bild. 2. Totalt 92% av möss (n = 50) infekterade med Salmonella-stammar PhoP C, 78% PhoP c Avra-, eller 70% PhoP c AvrA-/AvrA + kan överleva med ihållande salmonella i tarmen. Efter akut infektion, all överlevande fortfarande salmonella, som kan upptäckas efter infektion 6 månader med hjälp av den metod som beskrivs i detta förslag. När mössen överleva 3 veckor efter infektion, fick möss kroppsvikt och mindre dödsfallet inträffade (Fig.2). Dessutom immunofluroscence färgning uppgifter visar också att invasionen av salmonella i tarmslemhinnan 27 veckor efter infektion (Fig. 3). Dessa data visade att PhoP c, PhoP c Avra-eller PhoP c AvrA-/AvrA + kan användas för kronisk infektion modell.
Möss med värd motstånd faktor Nramp1 + / + är resistenta mot Salmonella infektion 3-6. C57/BL6 möss med Nramp defekta var användning i den aktuella studierna. Vi fann att 90% möss infekterade med patogena Salmonella stam 14028s inte kan överleva under 4 veckor (data visas inte). För att förstå de långsiktiga effekterna av vild-typ S. Typhimurium infektion, + / + möss med Nampr1 kunde användas.
Denna modell är etablerad i en BSL-2 laboratorium. Vårt protokoll är godkänt av University of Rochester University kommittén för djurs Resurser (UCAR). Möss infekterade med salmonella kommer sannolikt att lida obehag och ångest och blir mindre aktiva och röra sig långsamt. Deras päls kan bli ruggig och de får inte mata eller dricka som vanligt. Djuren ska observeras noga och om några tecken på obehag som inte kan pendla tillräckligt bra för att upprätthålla hydrering och kaloriintaget Om en mus visade tecken på att det hade aspirerade vätska eller betydande viktnedgång (10% eller mer) 7, och gjorde inte dö omedelbart, var musen humant avlivas. Alla laboratorium personal kommer att utbildas iobservera möss lämpligt 8, 9.
Många studier använde streptomycin-förbehandling har dragit nytta av kolit inducerad av Salmonella typhimurium för studier i det tidiga skedet av infektionen 1,2,10. Men bara några få rapport om kronisk infektion i musmodell in vivo-11. Möss med Salmonella ihållande existens i mag-tarmkanalen ger oss möjlighet att utforska den långsiktiga host-bakteriell interaktion, signaltransduktion, och Tumörgenesens. Vi har etablerat en kronisk bakteriell infekterad musmodell med Salmonella typhimurium kolonisationen i musen tarmen över 6 månader. Denna modell kan även användas för E.coli patogenes och probiotika studier. Sammantaget kommer detta protokoll bistånd forskare med musen sätt att hantera principiellt viktiga biologiska och mikrobiologiska frågor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NIDDK KO1 DK075386 bidrag och American Cancer Society RSG-09-075-01-MBC till juni Sön
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS | Sigma-Aldrich | ABCD1234 | |
| Luria-Bertani broth | BD Biosciences | 244610 | |
| Feeding needle | Popper & Sons, Inc. | 7920 | |
| Streptomycin | MP Biomedicals | 100556 | |
| BBL CHROMagar Salmonella | BD Biosciences | 214983 | |
| Disposable cell spreaders | Biologix Research Company | 65-1010 |
References
- Duan, Y. beta-Catenin activity negatively regulates bacteria-induced inflammation. Lab Invest. 87 (6), 613-624 (2007).
- Barthel, M. Pretreatment of mice with streptomycin provides a Salmonella enterica serovar Typhimurium colitis model that allows analysis of both pathogen and host. Infection and immunity. 71 (5), 2839-2858 (2003).
- Miller, S. I., Mekalanos, J. J. Constitutive expression of the phoP regulon attenuates Salmonella virulence and survival within macrophages. Journal of bacteriology. 172 (5), 2485-2490 (1990).
- Valdez, Y. Nramp1 expression by dendritic cells modulates inflammatory responses during Salmonella Typhimurium infection. Cell Microbiol. 10 (8), 1646-1661 (2008).
- Woo, H., Okamoto, S., Guiney, D., Gunn, J. S., Fierer, J. A model of Salmonella colitis with features of diarrhea in SLC11A1 wild-type mice. PLoS ONE. 3 (2), e1603-e1603 (2008).
- Dangl, J. L. Molecular call-and-response: how Salmonella learns the gospel from its host. Trends Microbiol. 11 (6), 245-246 (2003).
- Zaharik, M. L., Vallance, B. A., Puente, J. L., Gros, P., Finlay, B. B. Host-pathogen interactions: Host resistance factor Nramp1 up-regulates the expression of Salmonella pathogenicity island-2 virulence genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 15705-15710 (2002).
- Townsend, P., Morton, D. B. Laboratory Animal Care Policies and Regulations: United Kingdom. ILAR J. 37 (2), 68-74 (1995).
- Olfert, E. D., Godson, D. L. Humane endpoints for infectious disease animal models. ILAR J. 41 (2), 99-104 (2000).
- Ye, Z., Petrof, E. O., Boone, D., Claud, E. C., Sun, J. Salmonella effector AvrA regulation of colonic epithelial cell inflammation by deubiquitination. Am J Pathol. 171 (3), 882-892 (2007).
- Grassl, G. A., Valdez, Y., Bergstrom, K. S., Vallance, B. A., Finlay, B. B. Chronic enteric salmonella infection in mice leads to severe and persiste nt intestinal fibrosis. Gastroenterology. 134 (3), 768-780 (2008).
- Sukupolvi, S., Edelstein, A., Rhen, M., Normark, S. J., Pfeifer, J. D. Development of a murine model of chronic Salmonella infection. Infection and immunity. 65 (2), 838-842 (1997).
- Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). , Fifth Edition, US Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention and National Institutes of Health. (2007).
- Wu, S., Lu, R., Zhang, Y., Sun, J. Chronic effects of a Salmonella type III secretion effector protein AvrA in vivo. PLoS ONE. , Forthcoming (2010).
