Summary
Se establecieron modelos de ratón de leucomalacia periventricular (LPV), la lesión cerebral predominante en los bebés prematuros se caracteriza por lesiones de sustancia blanca periventricular. Hipoxia / isquemia con / sin infección sistémica son las causas principales de la FPV. La ligadura de carótida unilateral y la exposición hipoxia con / sin inyección de lipopolisacárido crea PVL-como lesiones en los ratones P6.
Abstract
Se describe un protocolo para el establecimiento de modelos de ratón de la leucomalacia periventricular (PVL). PVL es la forma predominante de la lesión cerebral en los bebés prematuros y el antecedente más común de parálisis cerebral. PVL se caracteriza por daño la sustancia blanca periventricular, con lesiones oligodendroglial prominentes. Hipoxia / isquemia, con o sin infección sistémica / inflamación son las principales causas de la FPV. Nosotros usamos ratones P6 para crear modelos de lesión cerebral neonatal mediante la inducción de hipoxia / isquemia, con o sin infección sistémica / inflamación con la ligadura de carótida unilateral seguida por la exposición a la hipoxia, con o sin la inyección de la endotoxina lipopolisacárido (LPS). Inmunohistoquímica de la proteína básica de mielina (MBP) o O1 y el examen microscópico electrónico muestran la pérdida de mielina prominentes en la sustancia blanca cerebral con daño adicional en el hipocampo y el tálamo. Establecimiento de modelos de ratón de PVL facilitará en gran medida el estudio de la patogénesis de la enfermedad utilizando disponibles cepas de ratones transgénicos, la conducción de los ensayos de medicamentos de una manera relativamente alto rendimiento para identificar posibles agentes terapéuticos, y el ensayo de transplante de células madre utilizando cepas de inmunodeficiencia ratón.
Protocol
Los procedimientos detallados de la creación de una lesión cerebral neonatal en ratones P6:
- Después del parto el día 6 (P6) de los ratones se anestesian con enfriamiento indirecto en el hielo hasta el punto de falta de respuesta a estímulos dolorosos (anestesia profunda).
- Después de limpiar la piel con alcohol, una incisión en la línea media ventral se hace en la parte anterior del cuello.
- Bajo un microscopio de disección, la bifurcación de la arteria carótida común derecha se acerca suavemente retracción de los músculos omohioideo y esternocleidomastoideo.
- La fascia alrededor de la vaina carotídea se retira, y la rama interna proximal aislada del nervio vago y cerca ganglios simpáticos con un gancho. La arteria carótida interna se cauteriza con una punta de la cauterización.
- Después de la cauterización, la incisión se sutura la piel, y el animal se mantiene caliente hasta que esté completamente despierto y luego regresó a la presa.
- Una hora después de la ligadura, el animal se coloca en una cámara sellada impregnada de nitrógeno hasta un nivel del 6,0% de O 2 se alcanza. El animal se expone a 35 min de hipoxia.
- Después de la exposición la hipoxia, el ratón se recupera en un cojín de la calefacción (33 ° C) durante 30 minutos y luego se devuelve a la presa. Para la creación de la lesión cerebral a la hipoxia combinada / isquemia y la infección / inflamación, el animal se inyecta por vía intraperitoneal con 0,015 ml de lipopolisacárido (LPS, 1 mg / kg).
- Cuatro días post-hypoxia/ischemia, los ratones se anestesian con enfriamiento indirecto en el hielo hasta el punto de falta de respuesta a los estímulos nocivos, entonces perfundidos con paraformaldehido 4% de solución salina y después. Los cerebros se retiran y se crioprotegieron.
Figura 1. Caracterización de la lesión cerebral en el modelo murino de hipoxia / isquemia con tinción H & E. No hay necrosis focal (flechas) en la sustancia blanca cerebral ipsilateral (A) de la ligadura de la carótida, en comparación con la sustancia blanca cerebral contralateral (B). Necrosis ipsilateral y microinfartos focales se observan en el hipocampo (C) y el tálamo (D) en el cerebro con una lesión cerebral ipsilateral materia blanca.
Los resultados representativos y cifras:
Modelos de ratón de PVL con hipoxia / isquemia y / o infección / inflamación se logran mediante la ligadura de carótida unilateral seguida por la exposición a la hipoxia y la inyección de LPS. Estamos definiendo los modelos de ratón nuevos modelos adecuados PVL. El examen neuropatológico de las secciones coronal teñidas con hematoxilina y eosina (H & E) a través del cerebro anterior revela toda necrosis focal en la materia blanca central del hemisferio cerebral ipsilateral a la ligadura de la carótida (Fig. 1A), con preservación relativa de las neuronas en la corteza que recubre cerebral en comparación con la sustancia blanca cerebral contralateral (Fig. 1B). En el centro de sustancia blanca necrótico, hay un marcado aumento de la celularidad que consiste en macrófagos y astrocitos reactivos, como es característico de PVL humanos focal. En el contralateral sustancia blanca central, el núcleo oligodendroglial están dispuestos en fascicular, como haces, esta arquitectura es completamente alterada por la necrosis focal en el lado ipsilateral. Es de destacar que también se observa necrosis ipsilateral en el hipocampo (Fig. 1C) y el tálamo (microinfartos focales) (Fig. 1D) en el cerebro con una lesión cerebral ipsilateral materia blanca. PVL humanos tampoco se produce en un aislamiento total de las lesiones que acompañan la materia gris. El sello distintivo de PVL es la relación, aunque no completa, ahorradores de la corteza cerebral que recubre el asunto heridos blanco - una característica que creemos que está presente en nuestros modelos de ratón.
Figura 2. Escala de puntuación de 0-5 para la evaluación de lesiones de sustancia blanca por MBP o O1 en modelos de ratón de la leucomalacia periventricular.
Nuestros modelos de ratón muestran las características de la FPV, tanto a nivel fenotípico y molecular. Hemos utilizado la detección inmunohistoquímica de la proteína básica de mielina (MBP) o antígeno O1 para evaluar una lesión, han establecido una escala estándar de 0 a 5 de la puntuación de la lesión de sustancia blanca (Fig. 2), y han caracterizado a la patología de la sustancia blanca (Fig. . 3). Más recientemente, un ensayo de no sesgada estereológicos se ha implementado para sustituir a la primera semi-cuantitativos método. Además, para probar los efectos correlativos de la lesión de sustancia blanca en los resultados funcionales, se han realizado pruebas de comportamiento de la función motora. Hemos demostrado que los ratones presentan déficit motor impresionante a la hipoxia siguientes P10-21 / isquemia más LPS en P6. Hemos establecido los criterios de puntuación con una escala de 0-4 para definir la disfunción extremidad contralateral en ratones heridos en P10-21. Por lo general, los ratones normales se pueden corretear de un 30 ° de inclinación (puntuación de 4) y sube a 45 ° de inclinación, sin deslizamiento (puntuación de 3). Los ratones lesionados tienen puntuaciones más bajas en correlación con los grados de lesión de sustancia blanca.
Figura 3. Caracterización de lesiones de sustancia blanca por MBP o O1 coloración y la estructura de la mielina por microscopía electrónica (EM). MBP y tinción O1 mostrar la mielina perdida en la sustancia blanca cerebral ipsilateral a la ligadura, en comparación con la sustancia blanca contralateral. Examen EM muestra axones mielinizados en la sustancia blanca cerebral contralateral a la ligadura y el tejido degenerado en la materia blanca ipsilateral.
Anticipamos que el establecimiento de los modelos de ratón de nuevo PVL nos permitirá estudiar los mecanismos específicos de PVL-como la lesión del cerebro inmaduro. Nos ocuparemos de la patogénesis utilizando cepas de ratones transgénicos para examinar el papel de las moléculas individuales de interés y evaluar los objetivos de la neuroprotección.
Discussion
La lesión del cerebro en desarrollo lleva a devastadoras consecuencias neurológicas. Sorprendentemente, el patrón de la lesión cerebral perinatal es altamente dependiente de la edad. En recién nacidos a término, que afecta principalmente a la corteza cerebral con pérdida neuronal característica. Sin embargo, en los bebés prematuros, que afecta selectivamente la materia blanca cerebral con daño importante a los oligodendrocitos en desarrollo, un trastorno denominado leucomalacia periventricular (LPV). La magnitud del problema de las lesiones cerebrales en el bebé prematuro es extraordinario. Parto prematuro y la mejora de los cuidados intensivos neonatales han llevado a casi el 90% de supervivencia de los 13 millones de niños prematuros en todo el mundo (aproximadamente 56.000 en los Estados Unidos), nacido el año con un peso al nacer inferior a 1500 gramos, es decir, de muy bajo peso al nacer. Aproximadamente el 10% de los sobrevivientes posteriormente presentan parálisis cerebral y aproximadamente el 50% tienen déficits cognitivos y de comportamiento. PVL es el cerebro más importante de la patología subyacente parálisis cerebral en recién nacidos prematuros. No hay tratamiento específico para PVL existe en la actualidad, en parte debido a la patogenia no ha sido bien entendido 1,2.
Aunque la etiología de la CVP es multifactorial, hipoxia perinatal / isquemia con infección intrauterina materna se cree que es una causa primaria de la FPV. Un modelo de hipoxia / isquemia del PVL en la rata a P7 ha sido establecido con anterioridad 3. Este modelo es único en el que se asemeja a LPV en recién nacidos prematuros. El sello distintivo de este modelo es selectiva de la materia blanca patología, a diferencia de la mayoría de los modelos de carrera que se caracterizan por un infarto de la materia gris. Sin embargo, las limitaciones del modelo hipóxico-isquémica en la rata no debe pasarse por alto. En primer lugar, la etiología de la CVP suele ser multifactorial. Además de la hipoxia / isquemia, materno-fetal infección / inflamación se asocia fuertemente con la FPV. Por lo tanto, la inflamación combinado hipoxia / isquemia y la infección / probable que crear modelos más PVL-como. La edad de roedores que mejor se correlaciona con el período de desarrollo humano de mayor riesgo de lesiones PVL (24-32 semanas de gestación) es después del parto porque la diferenciación oligodendroglial es predominantemente un evento post-natal en los roedores. Ya que es imposible producir una infección materno-fetal / inflamación de edad posnatal, que sería razonable para simular una infección en una fase de desarrollo postnatal relevante para crear un modelo de roedores de la FPV. Hemos tratado de combinar la inyección de LPS con el modelo de hipoxia / isquemia en ratones a P6, para producir lesiones PVL más clínicamente relevante. En segundo lugar, el óptimo de prueba de concepto de enfoque experimental para un papel causal de una molécula hace necesario el uso de ratones transgénicos, la manipulación genética son mucho más difíciles en la rata que en el ratón. Por lo tanto, hemos tratado de convertir nuestro modelo experimental de PVL de la rata en el ratón.
Modelos de ratón de PVL facilitará en gran medida 1) el estudio de la biología de la enfermedad y la patogénesis utilizando disponibles cepas de ratones transgénicos, 2) la realización de ensayos de medicamentos para descubrir posibles agentes con potencial terapéutico, y 3) las pruebas de la utilidad de las células madre utilizando cepas inmunodeficientes ratón.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo está apoyado en parte por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (SR1 NS059043 y ES015988 SR1), la Sociedad Nacional de Esclerosis Múltiple, Fundación Roche para la Investigación de la Anemia, Feldstein Fundación Médica y Hospitales Shriners para niños.
Nos gustaría agradecer al Dr. David Placer por sus sugerencias. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones de WD de los Institutos Nacionales de Salud (SR1 NS059043 y ES015988 SR1), la Sociedad Nacional de Esclerosis Múltiple, y los Hospitales Shriners para Niños. Declaramos que no hay intereses contrapuestos en relación con este artículo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LPS | Sigma-Aldrich | L4130 | |
| Hypoxia Chamber | BioSpherix | A-30274 | |
| Surgical hook | F.S.T. | 10064-14 |
References
- Volpe, J. J. Neurology of newborn. , Saunders. Philadelphia. 217-276 (2001).
- Deng, W., Pleasure, J., Pleasure, D.
- Follett, P. L., Deng, W., Dai, W., Talos, D. M., Massillon, L. J., Rosenberg, P. A., Volpe, J. J., Jensen, F. E. Glutamate receptor-mediated oligodendrocyte toxicity in periventricular leukomalacia: a protective role for topiramate. J. Neurosci. 24, 4412-4420 (2004).
