Summary
Demonstrado neste vídeo são as técnicas de congelamento instantâneo e secção tecido cerebral embrionário de rato. Dicas úteis para usar o criostato são dadas, incluindo métodos de solução de problemas que podem ser usados durante o corte para garantir que as seções resultantes tecidos estão livres de rachaduras e outras distorções.
Protocol
- Fix tecido em paraformaldeído 4% em PBS para o tempo desejado.
- Tecido sacarose infundir (crioproteção)
- Fazer solução de sacarose 30% em PBS w / v em 2059 tubo.
- Enxaguar tecido em 3x PBS (~ 5 min com balanço).
- Tecido lugar em solução de sacarose 30%. Tecido não vai afundar.
- Coloque o tecido em 4 ° C durante a noite, ou até que tenha afundado.
- Tamanho da etiqueta apropriada cryomold com informação e orientação.
- Preencha cryomold com outubro (evitar bolhas).
- Transferência de tecido para outubro de banho e bata-a com outubro
- Transferência de tecido para outubro em cryomold.
- Orientar o tecido sob o microscópio.
- Despeje nitrogênio líquido em placa de Petri de plástico.
- Rápida e cuidadosamente inferior do tecido em cryomold no nitrogênio. (Não submergir o topo da cryomold.)
- Quando o OCT é sólido branco, coloque o tecido congelado em freezer -80 ° C para armazenamento.
- Equilibrar tecido para ~ 20 ° C por pelo menos 30 min. antes do corte.
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Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Tissue-Tek Cryomold | Ted Pella, Inc. | 27181 | |
O.C.T. | Ted Pella, Inc. | 27050 | |
Sucrose solution | 30% sucrose solution in PBS w/v | ||
paraformaldehyde | 4% paraformaldehyde in PBS |