Summary
نحن تصف طريقة لتحليل ميكروأري لتحديد مستويات aminoacylation النسبية للجميع من tRNAs
Abstract
aminoacylation الحمض الريبي النووي النقال ، أو الشحن ، يمكن أن تتغير بسرعة المستويات داخل الخلية استجابة للبيئة [1]. التغيرات في مستويات الحمض الريبي النووي النقال الشحن على حد سواء في الخلايا حقيقية النواة بدائية وتؤدي الى تنظيم متعدية وهو آلية رئيسية للاستجابة الخلوية الإجهاد. الأمثلة المألوفة هي استجابة الصارمة في
Protocol
الجزء 1 : عزل الحمض الريبي النووي النقال مجموع المتهمين
- بيليه الخلايا في جهاز للطرد المركزي في منضدية RFC 2000 لمدة 5 دقائق. ينبغي أن يعادل 1 OD 600 من خلايا تنتج ما لا يقل عن مجموع 1μg من الحمض النووي الريبي ، ويوصى حد أدنى من 30 ميكروغرام لهذا الإجراء.
- مخزنة في خلايا Resuspend حل العازلة تحلل تتكون من 0.3 M - خلات الصوديوم + (الرقم الهيدروجيني 4.5) و 10 ملي EDTA. دوامة مع حجم مساو من نا + - خلات المشبعة الفينول / الكلوروفورم (الرقم الهيدروجيني 4.5) ثلاث مرات كل ثانية لمدة 30 ومن المؤكد أن تبقي دائما على عينات الجليد بين vortexing. يمكن تحضير خلات مخزنة من NaOAC وHOAc بينما خلات المشبعة يمكن أن تكون على استعداد الفينول / الكلوروفورم عن طريق خلط 1 جزء 5 M مخزنة خلات (الرقم الهيدروجيني 4.5) مع 9 أجزاء الفينول / الكلوروفورم.
ملاحظة : يتم عزل الحمض النووي الريبي مجموع في ظل ظروف أقل ما يقال الحمضية والجليد لتجنب deacylation من الحمض الريبي النووي النقال المشحونة. - الطرد المركزي في RFC 18600 لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية. إزالة الطبقة المائية وأداء آخر استخراج خلات المشبعة الفينول / الكلوروفورم.
- بعد استخراج second يعجل RNA عن طريق إضافة وحدات التخزين 2.7x من الإيثانول والطرد المركزي في RFC 18600 لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية.
- Resuspend الكريات RNA في حل العازلة تحلل ثم تترسب مع الايثانول مرة ثانية.
- أخيرا ، resuspend الحمض النووي الريبي في محلول يحتوي على 10 ملي خلات مخزنة (الرقم الهيدروجيني 4.5) و 1 ملي EDTA لمعالجة لاحقة. ويمكن تخزين العينة في ستابلي -80 درجة مئوية لمدة أسبوعين تقريبا. لا ينصح يعد التخزين كما اتهم بعض الحمض الريبي النووي النقال ستبدأ deacylate.
الجزء 2 : إعداد معايير الحمض الريبي النووي النقال
- الحرارة E. القولونية معايير الحمض الريبي النووي النقال بنسبة 10.5 ميكرومتر إلى 85 درجة مئوية في 45 درجة الحموضة تريس - CL 7.5 ملي مول لمدة 2 دقيقة. أخذ أنبوب خارج وترك في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق.
- 2 MgCl إضافة إلى التركيز النهائي من 20 ملم واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- إضافة مزيج التفاعل مخلقة ذلك التفاعل النهائي يحتوي على الحمض الريبي النووي النقال 5 ميكرون ، 60 مم ، تريس حمض الهيدروكلوريك (7.5 درجة الحموضة) ، 12.5 ملم MgCl 2 و 10 ملي بوكل ، 3 مم dithiothreitol ، 1.5 ملي ATP ، 1 ملم السبيرمين ، 1 ملم من كل حمض أميني ، ووحدات 4.2 / E. ميكرولتر مزيج القولونية مخلقة أمينوأسيل - الحمض الريبي النووي النقال. احتضان في 37 لمدة 15 دقائق درجة مئوية.
- إضافة حجم مساو من خلات M 0.5 مخزنة (الرقم الهيدروجيني 4.5) ، واستخراج الفينول مع 3 / CHCL خلات المشبعة عند pH 4.5.
- ترسيب الحمض الريبي النووي النقال مع وحدات التخزين المعايير 2.7x من الإيثانول والطرد المركزي في RFC 18600 لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية.
- Resuspend المعايير في خلات 50 مم مخزنة (الرقم الهيدروجيني 4.5) مع EDTA 1 مم وتخزينها في -80 درجة مئوية لمدة تصل الى شهر واحد.
الجزء 3 : Cy3/Cy5 توسيم الحمض الريبي النووي النقال
- لعينة الحمض الريبي النووي النقال اتهم احتضان الحمض النووي الريبي مجموع بتركيز 0.1 ميكروغرام / ميكرولتر مع 0.066 ميكرومتر كل E. القولونية معايير الحمض الريبي النووي النقال (أي 0.67 pmole كل معيار ميكروغرام في الحمض النووي الريبي الكل) و 100 ملي خلات مخزنة (الرقم الهيدروجيني 4.5) في حضور NaIO4 50 ملم لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. لمكافحة الاستعمال الكلي للعينة الحمض الريبي النووي النقال 50 ملي كلوريد الصوديوم في مكان NaIO4. تذكر أن يخفف من الحمض النووي الريبي فقط مع حلول مخزنة للحفاظ على الشحن.
- رد فعل لإرواء إضافة السكر إلى 100 ملم ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
- من أجل إزالة أي NaIO4 المتبقية من العينة إجراء تبادل العازلة باستخدام عمود الدوران G25. للحصول على أفضل النتائج يوازن العمود الأول عن طريق تشغيل 200 ملي العازلة خلات مخزنة (الرقم الهيدروجيني 4.5) من خلال ذلك قبل تطبيق عينتك.
- ترسيب العينة بإضافة خلات مخزنة (الرقم الهيدروجيني 4.5) إلى تركيز النهائي من 133 ملم وكلوريد الصوديوم إلى تركيز النهائي من 66 ملم وكميات 2.7x من الايثانول. أحيانا قد تكون هناك حاجة لهطول الأمطار الثاني للعينات أكسدة. هذا ضروري فقط إذا كان بيليه تبدو مختلفة كثيرا عن بيليه السيطرة على نفس العينة. على سبيل المثال بيليه أكبر بكثير أو أكثر انتشارا. إذا كنت بحاجة لهطول الأمطار الايثانول second resuspend بيليه في 50 ملي خلات الحموضة عازلة 4.5 و 200 ملي كلوريد الصوديوم قبل إضافة الايثانول.
- لdeacylation هي عينات الحمض الريبي النووي النقال معلق في 50 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 9) وحضنت في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. هو تحييد التفاعل من خلال إضافة حجم مساو من خلات 50 مم مخزنة (الرقم الهيدروجيني 4.5) ، و 100 ملي مول كلوريد الصوديوم. راسب مع وحدات التخزين 2.7x من الايثانول. بعد هطول الأمطار ، وغير معلق على الحمض النووي الريبي في الماء ~ 1 ميكروغرام / ميكرولتر. يجب تشغيل كل من السيطرة والمواد الهلامية على عينات تتأكسد لفحص الحمض النووي الريبي agarose الجودة.
- تعلق به الفلورية بنسبة ضئيلة على الحمض النووي الريبي الحمض الريبي النووي النقال ميكروغرام / ميكرولتر 0.1 deacylated هو المحتضنة في المخزن يغاز 1X ، DMSO 15 ٪ ، 4 ميكرومتر Cy3 أو المحتوية على Cy5 [أليغنوكليوتيد] ، وحدات 0.5 / ميكرولتر يغاز T4 الحمض النووي ، وخميرة الفوسفاتيز EXO - (5000 وحدة / ميكرولتر) عند 16 درجة مئوية خلال الليل (أكثر من 16 ساعة). وEXO - الفوسفاتيز هو ضروري فقط من أجل الحصول على عينات من الخميرة ، ويمكن omitteد إذا تم استخدام هذا البروتوكول لE. كولاي أو العينات البشرية.
- بعد أن يتم ربط عينات مختلطة مع 4 مجلدات من KOAc 50 ملم (الرقم الهيدروجيني 7) ، 200 ملي بوكل ، ومن ثم استخراج مع حجم مساو من كلوروفورم الفينول /. بعد استخراج المرحلة المائية ، وعجلت الاستعدادات RNA مع الإيثانول ومعلق في الماء لحوالي 0،1 ميكروغرام / ميكرولتر.
- ويمكن تقييم كفاءة الربط عن طريق تشغيل 5-10 ٪ من العينات في المواد الهلامية التي تحتوي على 12 ٪ بولي أكريلاميد 7M اليوريا وتصور مع ماسح ضوئي هلام الفلورسنت. هذا التحليل PAGE مفيد أيضا لتحديد كمية المؤكسد والعينات اللازمة للسيطرة ميكروأري التهجين. وينبغي أن يكون نتيجة جيدة تظهر ربط ~ يجري ligated 10 ٪ أو أكثر من قليل النوكليوتيد Cy3/Cy5 تحتوي على الحمض الريبي النووي النقال. للحصول على عينات من الكفاءة وضع العلامات الجيدة ، ويستخدم الحمض النووي الريبي مجموع 0،1-0،5 ميكروغرام لكل عينة لتهجين الصفيف.
الجزء 4 : تهجين وتحليل ميكروأري
- يتم غليه قبل الشرائح ميكروأري التهجين في الماء المقطر لمدة 1-2 دقائق لإزالة غير منضم [أليغنوكليوتيد].
- يتم تجميع عينات Cy3/Cy5 المسمى مع 140 ميكرولتر من العازلة التهجين الحمض النووي والسلمون الحيوانات المنوية إلى تركيز النهائي من 140 ميكروغرام / مل وبولي (أ) إلى التركيز النهائي من 70 ميكروغرام / مل.
- يتم تشغيل برنامج التهجين ، (الجدول 1) ، على مجموعة hybridizer التلقائي. الحمض الريبي النووي النقال للعمل ، فإنه يوصى بشدة أن يتم استخدام جهاز التهجين الآلي منذ التهجين دليل تنتج خلفية عالية.
- بعد اكتمال برنامج تغسل يدويا الشرائح مع الحل 3 اغسل مرتين على الأقل عن طريق هز برفق في أنبوب مخروطي 50 مل لمدة 3-5 دقائق.
- يمكن أن تجفف الشرائح بواسطة الطرد المركزي على سرعة منخفضة ، وأقل من 200 RFC ، لمدة 5-10 دقائق. فمن المهم للحفاظ على شرائح من الضوء منذ التعرض للضوء وتبييض fluorophores.
- وينبغي أن يتم تجفيفها بعد الشرائح يتم فحصها على الفور من أجل تحقيق النتائج المثلى ؛ إذا لزم الأمر يمكن حفظها لعدة أيام في مكان مظلم جاف في درجة حرارة الغرفة. يمكن مسحها الشرائح 2-3 مرات دون تدهور ملحوظ في جودة الصورة.
الجزء 5 : نتائج الممثل
عندما معزولة بشكل صحيح يجب على عينة الحمض النووي الريبي مجموع إنتاج الطيف نظيفة جدا مع 260 OD : OD 280 بالقرب من نسبة 2. وينبغي أن يكون هناك كشف البروتين أو التلوث الفينول. عندما تعمل على 1 ٪ agarose المواد الهلامية ، ينبغي ملاحظة وجود الفرقة الحمض الريبي النووي النقال قوية مع الفرق الأخرى الممكنة الحمض النووي بين الكائنات الحية المختلفة. وينبغي أن يلاحظ بعد أكسدة الحمض الريبي النووي النقال فرقة نظيفة. إذا كانت العينة هو أضعف مما هو ملحوظ لاحظ عينات أخرى أو تلطيخ ، لا ينبغي أن تستخدم لعينات ميكروأرس. وينبغي أن يكون ميكروأرس خلفية منخفضة جدا وهو أمر من حجم أقل من التحقيق أضعف الحمض الريبي النووي النقال. خلفية عالية عادة ما يكون بسبب مشاكل خلال خطوات الغسيل. يمكن عادة يكون هذا ثابت من خلال إعداد الحلول الطازجة وتغسل جيدا وغسل جميع المعدات والأنابيب لإزالة SDS المتبقية وعجلت.
| خطوة | تفاصيل |
| يا الدائري تكييف | 75 درجة مئوية ، 2 دقيقة |
| إدخال نموذج | 60 درجة مئوية |
| تفسد نموذج | 90 درجة مئوية ، 5 دقائق |
| تهجين | 60 درجة مئوية ، 16H |
| يغسل 1 | 50 درجة مئوية ، 10S تدفق عقد 20S |
| غسل 2 | 42 درجة مئوية ، 10S تدفق عقد 20S |
| تغسل 3 | 42 درجة مئوية ، 10S تدفق عقد 20S |
الجدول رقم 1 : بروتوكول التهجين
Discussion
نقدم طريقة لتحديد المستويات النسبية في آن واحد لجميع tRNAs شحن على مستوى الجينوم. وقد تم تحسين بروتوكول المعروضة هنا للS. البيرة ، وأيضا تم استخدامه بنجاح لقياس ملامح شحن في الحمض الريبي النووي النقال E. القولونية والثقافات الخلية البشرية. ويمكن تعديله لاستيعاب أي كائن مع تسلسل الجينوم المعروفة (السماح لشرح جميع الجينات الحمض الريبي النووي النقال) طالما ويمكن الحصول على الحمض الريبي النووي النقال مجموع المشحونة.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وقد تم تمويل عمل الخميرة في المختبر عموم بواسطة منحة من اليابان Ajinomoto شركة ، والمعاهد الوطنية للصحة منح التدريب T32GM007183 - 33. نشكر الدكتور رونالد Wek في كلية الطب جامعة إنديانا لتعاون طويل الأجل في المشاريع الخميرة. كما نشكر الدكتور كيمبرلي Dittmar لتطوير الحمض الريبي النووي النقال شحن ميكروأري الأسلوب.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microspin G-25 columns | GE Healthcare | 25-5325-01 | |
| E. coli tRNAPhe | Sigma-Aldrich | R3143 | |
| E. coli tRNATyr | Sigma-Aldrich | R0258 | |
| E. coli tRNALys | Sigma-Aldrich | R6018 | |
| E. coli aminoacyl-tRNA synthetases | Sigma-Aldrich | A3646 | |
| T4 DNA ligase | USB Corp., Affymetrix | 70042X | |
| PerfectHyb Plus | Sigma-Aldrich | H-7033 | |
| Hyb4 station | Digilab | ||
| GenePix 4000B scanner | Axon instruments | ||
| GenePix 6.0 | Axon instruments |
References
- Zaborske, J. M. Genome-wide analysis of tRNA charging and activation of the eIF2 kinase Gcn2p. J Biol Chem. 284 (37), 25254-25267 (2009).
- Wek, S. A., Zhu, S., Wek, R. C. The histidyl-tRNA synthetase-related sequence in the eIF-2 alpha protein kinase GCN2 interacts with tRNA and is required for activation in response to starvation for different amino acids. Mol Cell Biol. , 4497-4506 (1995).
- Hinnebusch, A. G. Translational Regulation of GCN4 and the General Amino Acid Control of Yeast. Annual Review of Microbiology. 59 (1), 407-450 (2005).
- Braeken, K. New horizons for (p)ppGpp in bacterial and plant physiology. Trends in Microbiology. 14 (1), 45-54 (2006).
- Dong, J. Uncharged tRNA Activates GCN2 by Displacing the Protein Kinase Moiety from a Bipartite tRNA-Binding Domain. Molecular Cell. 6 (2), 269-279 (2000).
- Cashel, M. The Stringent Response. Escherichia coli and Salmonella: cellular and molecular biology. Neidhardt, F. C. , ASM Press. Washington DC. 1458-1496 (1996).
- Dittmar, K. A. Selective charging of tRNA isoacceptors induced by amino-acid starvation. EMBO Rep. 6 (2), 151-157 (2005).
- Zhou, Y. High levels of tRNA abundance and alteration of tRNA charging by bortezomib in multiple myeloma. Biochem Biophys Res Commun. 385 (2), 160-164 (2009).
![الجينوم على نطاق تحليل المستويات (شحن) من الحمض الريبي النووي النقال باستخدام Aminoacylation ميكروأرس]](https://cloudfront.jove.com/CDNSource/teasers/2007.jpg)
