Summary
Nous décrivons une méthode pour l'analyse des microréseaux pour déterminer les niveaux relatifs de tous aminoacylation ARNt partir
Abstract
aminoacylation d'ARNt, ou de chargement, les niveaux peuvent changer rapidement dans une cellule en réponse à l'environnement [1]. Les changements dans les niveaux de charge ARNt dans les cellules procaryotes et eucaryotes conduire à une réglementation translationnelle qui est un mécanisme cellulaire majeur de la réponse au stress. Exemples familiers sont la réponse strictes
Protocol
Partie 1: Isolement des ARNt chargés au total
- Pellet cellules dans une centrifugeuse de table à 2000 RFC pendant 5 minutes. L'équivalent d'une DO 600 de cellules devraient produire au moins 1 pg d'ARN total et un minimum de 30 ug est recommandé pour la procédure.
- Resuspendre les cellules dans une solution tampon de lyse composée de 0,3 M tamponné Na +-acétate (pH 4,5) et EDTA 10 mM. Vortex avec un volume égal de Na +-saturée d'acétate de phénol / chloroforme (pH 4,5) à trois reprises pour chacun des 30 s. Soyez sûr de toujours garder des échantillons sur la glace entre les vortex. D'acétate tamponné peuvent être préparés à partir de NaOAc et HOAc alors saturée d'acétate de phénol / chloroforme peut être préparée en mélangeant 1 partie d'acétate de 5 M tamponné (pH 4,5) avec 9 parties de phénol / chloroforme.
Note: Le total isolement d'ARN est réalisée dans des conditions légèrement acides et sur la glace pour éviter désacylation des ARNt chargés. - Centrifuger à 18600 RFC pendant 15 minutes à 4 ° C. Retirez la couche aqueuse et effectuer une autre extraction saturée d'acétate de phénol / chloroforme.
- Après la deuxième extraction précipiter l'ARN en ajoutant des volumes 2.7x de l'éthanol et centrifugation à 18 600 RFC pendant 30 minutes à 4 ° C.
- Resuspendre culots d'ARN en solution tampon de lyse puis précipité avec l'éthanol une seconde fois.
- Enfin, remettre en suspension les ARN dans une solution contenant 10 mM d'acétate tamponné (pH 4,5) et EDTA 1 mM pour le traitement ultérieur. L'échantillon peut être stocké de manière stable à -80 ° C pendant environ deux semaines. Un stockage prolongé n'est pas recommandé car certains ARNt chargés vont commencer à deacylate.
Partie 2: Préparation des étalons ARNt
- Chauffer E. coli normes ARNt à 10,5 uM à 85 ° C dans 45 mM de Tris-Cl pH 7,5 pendant 2 minutes. Prenez le tube et laisser à température ambiante pendant 3 minutes.
- Ajouter MgCl 2 à une concentration finale de 20 mM et incuber à 37 ° C pendant 5 minutes.
- Ajouter le mélange réactionnel synthétase sorte la réaction finale contient 5 uM, ARNt 60 mM Tris-HCl (pH 7,5), 12,5 mM de MgCl2, 10 mM de KCl, 3 mM de dithiothréitol, 1,5 mM d'ATP, 1 mM de spermine, 1 mM de l'respectifs acides aminés, et de 4,2 unités / ul E. mélangez synthétase coli aminoacyl-ARNt. Incuber à 37 ° C pendant 15 minutes.
- Ajouter un volume égal de 0,5 M d'acétate tamponné (pH 4,5) et l'extrait avec de l'acétate de phénol saturé / CHCl 3 à pH 4,5.
- Précipiter les normes ARNt avec des volumes d'éthanol et 2,7 x centrifugation à 18600 RFC pendant 30 minutes à 4 ° C.
- Resuspendre les normes dans 50 mM d'acétate tamponné (pH 4,5) avec 1 mM d'EDTA et conserver à -80 ° C jusqu'à un mois.
Partie 3: Cy3/Cy5 étiquetage des ARNt
- Pour l'échantillon ARNt chargés incuber l'ARN total à une concentration de 0,1 pg / pl avec 0,066 uM de chaque E. coli normes ARNt (c'est à dire 0,67 pmoles de chaque norme par ug d'ARN totaux) et 100 mM d'acétate tamponné (pH 4,5), en présence de 50 mM NaIO4 pendant 30 minutes à température ambiante. Pour le contrôle total de l'utilisation de l'échantillon ARNt 50 mM de NaCl à la place de NaIO4. N'oubliez pas de diluer l'ARN uniquement avec des solutions tamponnées à préserver la charge.
- Pour arrêter la réaction ajouter du glucose à 100 mm et incuber à température ambiante pendant 5 minutes.
- Afin de supprimer tout NaIO4 reste de l'échantillon effectuer un échange de tampon en utilisant une colonne spin G25. Pour de meilleurs résultats s'équilibrent la première colonne en exécutant 200 mM de tampon acétate tamponné (pH 4,5) à travers elle avant d'appliquer votre échantillon.
- Précipiter l'échantillon par addition d'acétate tamponné (pH 4,5) à une concentration finale de 133 mM de NaCl et à une concentration finale de 66 mM et 2,7 x le volume d'éthanol. Occasionnellement, une deuxième précipitation peut être nécessaire pour les échantillons oxydés. Cela est nécessaire seulement si le culot ressemble sensiblement différente de celle du culot de contrôle du même échantillon. Par exemple, une beaucoup plus grande ou plus diffus à granulés. Si une seconde précipitation à l'éthanol est nécessaire Resuspendre le culot dans 50 mM d'acétate de tampon pH 4,5 et 200 mM de NaCl, avant l'addition d'éthanol.
- Pour les échantillons désacylation ARNt sont remis en suspension dans 50 mM Tris-HCl (pH 9) et incubées à 37 ° C pendant 30 min. La réaction est neutralisée par l'addition d'un volume égal de 50 mM d'acétate tamponné (pH 4,5) et NaCl 100 mM. Précipiter avec des volumes d'éthanol 2.7x. Après la précipitation, l'ARN est remis en suspension dans l'eau à ~ 1 ug / ul. Tant le contrôle et les échantillons oxydés doit être exécuté sur des gels d'agarose pour vérifier la qualité de l'ARN.
- Pour fixer les balises oligo fluorescent sur l'ARNt 0,1 pg / pl désacylé ARN est incubé dans 1x tampon ligase, 15% de DMSO, 4 uM Cy3 ou Cy5 contenant des oligonucléotides, 0,5 unités / ul ADN ligase de T4, et la levure exo-phosphatase (5000 unités / ul) à 16 ° C pendant la nuit (plus de 16 h). L'exo-phosphatase est nécessaire seulement pour les échantillons obtenus à partir de la levure et peut être omitteD Si ce protocole est utilisé pour E. coli ou d'échantillons humains.
- Après la ligature des échantillons sont mélangés avec 4 volumes de 50 mM KOAc (pH 7), 200 mM de KCl, puis extraite avec un volume égal de phénol / chloroforme. Après extraction de la phase aqueuse, des préparations d'ARN sont précipités à l'éthanol et resuspendu dans de l'eau à environ 0,1 pg / pl.
- Ligature d'efficacité peut être évaluée en exécutant 5-10% des échantillons sur gels de polyacrylamide 12% contenant de l'urée 7M et visualisées avec un scanner de gel fluorescent. Cette analyse PAGE est également utile pour déterminer le montant des échantillons oxydés et de contrôle nécessaires pour l'hybridation de biopuces. Un résultat ligature doit montrer une bonne ~ 10% ou plus de l'oligonucléotide contenant Cy3/Cy5 être ligaturé à l'ARNt. Pour les échantillons dont l'efficacité en matière d'étiquetage, 0,1 à 0.5 mg d'ARN total par échantillon est utilisé pour l'hybridation tableau.
Partie 4: Hybridation et analyse des biopuces
- Avant de diapositives puces d'hybridation sont cuites à l'eau distillée pendant 1-2 minutes pour enlever les oligonucléotides non consolidés.
- Cy3/Cy5 échantillons étiquetés sont combinés avec 140 ul de tampon d'hybridation et de l'ADN de sperme de saumon à une concentration finale de 140 pg / ml et de poly (A) à une concentration finale de 70 pg / ml.
- Un programme d'hybridation, (tableau 1), est exécuté sur une large hybrideur automatique. Pour les travaux d'ARNt, il est fortement recommandé que l'hybridation d'une machine automatique être utilisée car l'hybridation manuelle produit de fond élevé.
- Après que le programme est terminé manuellement laver les lames avec une solution 3 Laver au moins deux fois en agitant dans un tube conique de 50 ml pendant 3-5 minutes.
- Les diapositives peuvent être séchées par centrifugation à basse vitesse, moins de 200 RFC, pendant 5-10 minutes. Il est important de garder la glisse hors de la lumière depuis l'exposition à la lumière va blanchir les fluorophores.
- Après les lames sont sèches, elles doivent être scannés immédiatement pour des résultats optimaux, si nécessaire, ils peuvent être sauvegardées pour plusieurs jours dans un endroit sec, sombre à la température ambiante. Les diapositives peuvent être scannées 2-3 fois sans dégradation notable de la qualité d'image.
Partie 5: Résultats Représentant
Lorsqu'elle est isolée correctement l'échantillon d'ARN totaux devraient produire un spectre très propre avec une 260 OD: DO 280 ratio de près de 2. Il devrait y avoir aucune protéine détectable ou de contamination de phénol. Lorsqu'il est exécuté sur 1% des gels d'agarose, une forte bande ARNt doivent être observées avec d'autres groupes possibles acide nucléique variant entre organismes. Après l'oxydation d'une bande propre ARNt doit être observé. Si un échantillon est sensiblement plus faible que d'autres échantillons ou des traînées est observé, les échantillons ne doivent pas être utilisés pour les microarrays. Microarrays devrait avoir de fond très bas, qui est un ordre de grandeur plus faible que les plus faibles de sonde ARNt. Bruit de fond élevé est généralement dû à des problèmes lors des étapes de lavage. Ceci peut habituellement être fixé par la préparation de solutions de lavage fraîche et bien laver tous les équipements et les tubes pour éliminer les résidus et les SDS précipité.
| Étape | Détails |
| Torique de conditionnement | 75 ° C, 2 min |
| Présentez l'échantillon | 60 ° C |
| Exemple Dénaturer | 90 ° C, 5 min |
| Hybridation | 60 ° C, 16h |
| Lavez 1 | 50 ° C, 10s 20s flux de maintenir |
| Lavez 2 | 42 ° C, 10s 20s flux de maintenir |
| Lavez 3 | 42 ° C, 10s 20s flux de maintenir |
Tableau 1: protocole d'hybridation
Discussion
Nous présentons une méthode pour déterminer simultanément les niveaux relatifs de chargement de tous les ARNt à l'échelle génomique. Le protocole présenté ici a été optimisé pour S. cerevisiae, et il a aussi été utilisée avec succès pour mesurer les profils de charge ARNt dans E. coli et de cultures de cellules humaines. Il peut être modifié pour accommoder tout organisme avec des séquences du génome connu (permettant l'annotation de tous les gènes d'ARNt) tant que le total ARNt chargés peuvent être obtenues.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Le travail de la levure dans le laboratoire de Pan a été financé par une subvention de Ajinomoto, Inc au Japon et National Institutes of Health Training Grant T32GM007183-33. Nous remercions le Dr Ronald Wek à l'École de médecine de l'Université d'Indiana pour la collaboration à long terme sur les projets de la levure. Nous remercions également le Dr Kimberly Dittmar pour développer l'ARNt méthode de recharge de biopuces.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microspin G-25 columns | GE Healthcare | 25-5325-01 | |
| E. coli tRNAPhe | Sigma-Aldrich | R3143 | |
| E. coli tRNATyr | Sigma-Aldrich | R0258 | |
| E. coli tRNALys | Sigma-Aldrich | R6018 | |
| E. coli aminoacyl-tRNA synthetases | Sigma-Aldrich | A3646 | |
| T4 DNA ligase | USB Corp., Affymetrix | 70042X | |
| PerfectHyb Plus | Sigma-Aldrich | H-7033 | |
| Hyb4 station | Digilab | ||
| GenePix 4000B scanner | Axon instruments | ||
| GenePix 6.0 | Axon instruments |
References
- Zaborske, J. M. Genome-wide analysis of tRNA charging and activation of the eIF2 kinase Gcn2p. J Biol Chem. 284 (37), 25254-25267 (2009).
- Wek, S. A., Zhu, S., Wek, R. C. The histidyl-tRNA synthetase-related sequence in the eIF-2 alpha protein kinase GCN2 interacts with tRNA and is required for activation in response to starvation for different amino acids. Mol Cell Biol. , 4497-4506 (1995).
- Hinnebusch, A. G. Translational Regulation of GCN4 and the General Amino Acid Control of Yeast. Annual Review of Microbiology. 59 (1), 407-450 (2005).
- Braeken, K. New horizons for (p)ppGpp in bacterial and plant physiology. Trends in Microbiology. 14 (1), 45-54 (2006).
- Dong, J. Uncharged tRNA Activates GCN2 by Displacing the Protein Kinase Moiety from a Bipartite tRNA-Binding Domain. Molecular Cell. 6 (2), 269-279 (2000).
- Cashel, M. The Stringent Response. Escherichia coli and Salmonella: cellular and molecular biology. Neidhardt, F. C. , ASM Press. Washington DC. 1458-1496 (1996).
- Dittmar, K. A. Selective charging of tRNA isoacceptors induced by amino-acid starvation. EMBO Rep. 6 (2), 151-157 (2005).
- Zhou, Y. High levels of tRNA abundance and alteration of tRNA charging by bortezomib in multiple myeloma. Biochem Biophys Res Commun. 385 (2), 160-164 (2009).
