Summary
Descriviamo un metodo per l'analisi di microarray per determinare i livelli aminoacylation relativa di tutti i tRNA da
Abstract
aminoacylation tRNA, o la ricarica, i livelli possono cambiare rapidamente all'interno di una cellula in risposta all'ambiente [1]. Cambiamenti nei livelli di tRNA di ricarica nelle cellule, sia procarioti ed eucarioti portare alla regolamentazione traslazionale, che è un importante meccanismo di risposta allo stress cellulare. Esempi familiari sono la risposta a rigorosi
Protocol
Parte 1: Isolamento del totale tRNA carico
- Celle di pellet in una centrifuga da tavolo a 2000 RFC per 5 minuti. L'equivalente di 1 OD 600 di cellule dovrebbero produrre almeno 1μg di RNA totale e un minimo di 30 mg è raccomandato per la procedura.
- Risospendere le cellule in lisi soluzione tampone costituito da 0,3 M tamponato Na +-acetato (pH 4,5) e 10 mM EDTA. Vortex con un uguale volume di Na +-saturata di acetato di fenolo / cloroformio (pH 4,5) per tre volte ciascuno per 30 s. Essere sicuri di mantenere sempre i campioni in ghiaccio tra vortex. Acetato tamponata possono essere preparati da NaOAC e HOAc mentre acetato saturi fenolo / cloroformio può essere preparata mescolando 1 parte 5 M tampone acetato (pH 4.5) con 9 parti di fenolo / cloroformio.
Nota: L'RNA totale isolamento viene effettuato in condizioni leggermente acida e sul ghiaccio per evitare deacylation di tRNA carica. - Centrifugare a 18.600 RFC per 15 minuti a 4 ° C. Rimuovere lo strato acquoso ed eseguire un altro saturata di acetato di estrazione fenolo / cloroformio.
- Dopo la seconda estrazione precipitare l'RNA con l'aggiunta di 2,7 x volumi di etanolo e la centrifugazione a 18.600 RFC per 30 minuti a 4 ° C.
- Risospendere pellet di RNA in una soluzione tampone di lisi e poi precipitare con etanolo una seconda volta.
- Infine, risospendere l'RNA in una soluzione contenente 10 mM di acetato tamponata (pH 4,5) e 1 mM EDTA per il successivo trattamento. Il campione può essere stabilmente conservati a -80 ° C per circa due settimane. Lunga conservazione non è raccomandato in quanto alcuni tRNA carico inizierà a deacylate.
Parte 2: elaborazione di norme tRNA
- Calore E. coli standard tRNA a 10,5 micron a 85 ° C in 45 mM Tris-Cl pH 7.5 per 2 minuti. Prendete il tubo e lasciare a temperatura ambiente per 3 minuti.
- Aggiungi MgCl 2 a una concentrazione finale di 20 mm e incubare a 37 ° C per 5 minuti.
- Aggiungere la miscela di reazione sintetasi così la reazione finale contiene 5 mM tRNA, 60 mM Tris-HCl (pH 7,5), 12,5 mM MgCl 2, 10 mM KCl, 3 mM ditiotreitolo, 1,5 mM ATP, 1 mM spermina, 1 mM dei rispettivi amminoacidi, e 4,2 unità / mL E. coli-tRNA sintetasi mix. Incubare a 37 ° C per 15 minuti.
- Aggiungere un volume equivalente di 0,5 M acetato tamponata (pH 4,5) ed estrarre con saturata di acetato di fenolo / CHCl 3 a pH 4,5.
- Precipitare gli standard tRNA con volumi 2,7 x di etanolo e la centrifugazione a 18.600 RFC per 30 minuti a 4 ° C.
- Risospendere gli standard in 50 mM acetato tamponata (pH 4,5) con 1 mM EDTA e conservare a -80 ° C per un massimo di un mese.
Parte 3: Cy3/Cy5 etichettatura dei tRNA
- Per il campione tRNA carico incubare RNA totale ad una concentrazione di 0,1 mg / mL con 0,066 mM ogni E. coli standard tRNA (cioè 0,67 pmole ogni standard per mcg RNA totale) e 100 mM di tampone acetato (pH 4,5) in presenza di 50 mM NaIO4 per 30 minuti a temperatura ambiente. Per il controllo totale del campione uso tRNA 50 mM NaCl al posto di NaIO4. Ricordati di diluire l'RNA solo con soluzioni tampone per conservare la carica.
- Per placare la reazione aggiungere il glucosio a 100 mm e incubare a temperatura ambiente per 5 minuti.
- Al fine di rimuovere ogni residuo NaIO4 dal campione effettuare uno scambio di buffer utilizzando una colonna di spin G25. Per ottenere i migliori risultati equilibrare la prima colonna eseguendo 200 mM tampone tamponata (pH 4,5) attraverso di essa prima di applicare il vostro campione.
- Precipitare il campione con l'aggiunta di acetato tamponata (pH 4.5) ad una concentrazione finale di 133 mM e NaCl ad una concentrazione finale di 66 mm e 2,7 x volumi di etanolo. Occasionalmente una precipitazione secondo può essere necessaria per i campioni ossidati. Ciò è necessario solo se il pellet appare significativamente diversa rispetto al pellet di controllo del campione stesso. Ad esempio, una molto più grandi o più diffuso pellet. Se una precipitazione in etanolo secondo è necessario risospendere pellet in 50 mM tampone acetato pH 4.5 e 200 mM di NaCl prima dell'aggiunta di etanolo.
- Per deacylation i campioni tRNA sono risospesi in 50 mM Tris-HCl (pH 9) e incubate a 37 ° C per 30 min. La reazione è neutralizzato con l'aggiunta di un uguale volume di 50 mM tampone acetato (pH 4,5) e 100 mM NaCl. Precipitato con 2,7 x volumi di etanolo. Dopo la precipitazione, l'RNA è risospeso in acqua a circa 1 mg / mL. Sia il controllo e campioni ossidato deve essere eseguito su gel di agarosio per verificare la qualità dell'RNA.
- Per collegare i tag oligo fluorescenti sul tRNA 0,1 mg / mL di RNA deacylated è incubato in 1x buffer di ligasi, 15% DMSO, 4 mM Cy3 o Cy5 contenenti oligonucleotidi, 0,5 unità / mL DNA ligasi T4, e lievito exo-fosfatasi (5.000 unità / mL) a 16 ° C per una notte (oltre 16 h). L'eso-fosfatasi è necessaria solo per i campioni ottenuti da lieviti e può essere omitted se questo protocollo è utilizzato per E. coli o di campioni umani.
- Dopo la legatura campioni vengono miscelati con 4 volumi di 50 mM KOAc (pH 7), 200 mM KCl, e poi estratto con un uguale volume di fenolo / cloroformio. Dopo l'estrazione della fase acquosa, le preparazioni di RNA sono precipitati con etanolo e risospeso in acqua per circa 0,1 mg / mL.
- Efficienza legatura può essere valutato eseguendo il 5-10% dei campioni su gel di poliacrilammide 12% a base di urea 7M e visualizzate con uno scanner gel fluorescenti. Questa analisi PAGINA è utile anche per determinare la quantità di ossidato e campioni di controllo necessari per l'ibridazione di microarray. Un buon risultato legatura dovrebbe mostrare ~ 10% o più del oligonucleotide Cy3/Cy5 contenente essere legatura al tRNA. Per i campioni con efficienza corretta etichettatura, 0,1-0,5 mg di RNA totale per campione è usato per l'ibridazione di array.
Parte 4: ibridazione e Analisi dei Microarray
- Prima di diapositive ibridazione microarray vengono bolliti in acqua distillata per 1-2 minuti per rimuovere oligonucleotidi non legati.
- Cy3/Cy5 campioni etichettati sono combinati con 140 ml di buffer di ibridazione e DNA spermatico salmone ad una concentrazione finale di 140 mg / ml e poli (A) ad una concentrazione finale di 70 mg / ml.
- Un programma di ibridazione, (tabella 1), viene eseguito su un Hybridizer serie automatica. Per lavori di tRNA, è altamente raccomandato che una macchina automatica ibridazione essere utilizzato in quanto l'ibridazione manuale produce fondo elevato.
- Dopo che il programma è completato manualmente lavare i vetrini con Lavare 3 soluzione almeno due volte agitando delicatamente in un tubo da 50 ml conica per 3-5 minuti.
- Le diapositive possono essere essiccati mediante centrifugazione a bassa velocità, meno di 200 RFC, per 5-10 minuti. E 'importante mantenere le diapositive dalla luce poiché l'esposizione alla luce la candeggina fluorofori.
- Dopo le diapositive sono secchi devono essere acquisiti immediatamente per ottenere risultati ottimali, se necessario, possono essere salvati per diversi giorni in un luogo asciutto buio a temperatura ambiente. Le diapositive possono essere acquisiti 2-3 volte senza degradazione nella qualità dell'immagine.
Parte 5: Risultati Rappresentante
Quando isolato correttamente il campione totale di RNA dovrebbe produrre uno spettro molto pulita con un 260 OD: OD 280 rapporto vicino a 2. Non ci dovrebbero essere proteine rilevabili o contaminazione fenolo. Quando viene eseguito il 1% gel di agarosio, un gruppo forte tRNA devono essere osservati con altre band possibili acido nucleico che varia tra gli organismi. Dopo l'ossidazione una band pulito tRNA devono essere osservati. Se un campione è notevolmente più debole di altri campioni o macchie si osserva, i campioni non devono essere utilizzati per microarray. Microarray dovrebbe avere sfondo molto basso, che è un ordine di grandezza inferiore a quello dei più deboli sonda tRNA. Elevato background è di solito a causa di problemi durante le fasi di lavaggio. Questo di solito può essere risolto preparando nuove soluzioni di lavaggio e lavaggio a fondo tutte le apparecchiature e le tubazioni per rimuovere residui e precipitato SDS.
| Passo | Dettagli |
| O-ring di condizionamento | 75 ° C, 2 min |
| Introdurre campione | 60 ° C |
| Esempio di denaturare | 90 ° C, 5 min |
| Ibridazione | 60 ° C, 16h |
| Lavare 1 | 50 ° C, 10s flusso tenere '20 |
| Lavare 2 | 42 ° C, 10s flusso tenere '20 |
| Lavare 3 | 42 ° C, 10s flusso tenere '20 |
Tabella 1: protocollo di ibridazione
Discussion
Vi presentiamo un metodo per determinare simultaneamente i livelli relativi di carica di tutti i tRNA su scala genomica. Il protocollo presentato qui è stato ottimizzato per S. cerevisiae, ed è anche stato utilizzato con successo per misurare profili tRNA carica in E. coli e colture di cellule umane. Può essere modificato per adattarsi a qualsiasi organismo con una sequenza genomica nota (che consente per l'annotazione di tutti i geni tRNA) finché totale tRNA carica può essere ottenuto.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Il lavoro lievito nel laboratorio Pan è stato finanziato da una sovvenzione da Ajinomoto, Inc. in Giappone e National Institutes of Health di formazione di Grant T32GM007183-33. Ringraziamo il Dott. Ronald Wek presso la Scuola di Medicina dell'Università dell'Indiana di collaborazione a lungo termine sui progetti di lievito. Ringraziamo anche il dottor Kimberly Dittmar per lo sviluppo del tRNA carica metodo microarray.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microspin G-25 columns | GE Healthcare | 25-5325-01 | |
| E. coli tRNAPhe | Sigma-Aldrich | R3143 | |
| E. coli tRNATyr | Sigma-Aldrich | R0258 | |
| E. coli tRNALys | Sigma-Aldrich | R6018 | |
| E. coli aminoacyl-tRNA synthetases | Sigma-Aldrich | A3646 | |
| T4 DNA ligase | USB Corp., Affymetrix | 70042X | |
| PerfectHyb Plus | Sigma-Aldrich | H-7033 | |
| Hyb4 station | Digilab | ||
| GenePix 4000B scanner | Axon instruments | ||
| GenePix 6.0 | Axon instruments |
References
- Zaborske, J. M. Genome-wide analysis of tRNA charging and activation of the eIF2 kinase Gcn2p. J Biol Chem. 284 (37), 25254-25267 (2009).
- Wek, S. A., Zhu, S., Wek, R. C. The histidyl-tRNA synthetase-related sequence in the eIF-2 alpha protein kinase GCN2 interacts with tRNA and is required for activation in response to starvation for different amino acids. Mol Cell Biol. , 4497-4506 (1995).
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