Summary
We beschrijven een methode voor microarray analyse om de relatieve aminoacylatie niveaus van alle tRNA's te bepalen van de
Abstract
tRNA aminoacylatie, of het opladen, kan het niveau snel veranderen in een cel in reactie op het milieu [1]. Veranderingen in de tRNA opladen niveaus in zowel prokaryotische en eukaryotische cellen leiden tot translationeel regeling die is een belangrijke cellulaire mechanismen van stress respons. Bekende voorbeelden zijn de strenge reactie in
Protocol
Deel 1: Isolatie van totaal geladen tRNA
- Pellet cellen in een tafelblad centrifuge bij 2000 RFC gedurende 5 minuten. Het equivalent van een OD 600 van de cellen moet over ten minste 1μg totaal RNA en een minimum van 30 ug wordt aanbevolen voor de procedure.
- Resuspendeer cellen in lysisbuffer oplossing die bestaat uit 0,3 M gebufferde Na +-acetaat (pH 4,5) en 10 mM EDTA. Vortex met een gelijk volume van Na +-acetaat-verzadigd fenol / chloroform (pH 4,5) drie keer per gedurende 30 s. Zorg ervoor dat u altijd steekproeven te houden op het ijs tussen vortexen. Gebufferde acetaat kunnen worden bereid uit NaOAc en HOAc terwijl acetaat verzadigd fenol / chloroform kunnen worden bereid door het mengen van 1 deel 5 M acetaat gebufferde (pH 4.5) met negen delen fenol / chloroform.
Let op: in totaal RNA isolatie wordt uitgevoerd onder mild zure condities en op het ijs te deacylering van geladen tRNA te voorkomen. - Centrifugeer bij 18.600 RFC gedurende 15 minuten bij 4 ° C. Verwijder de waterlaag en het uitvoeren van een acetaat-verzadigd fenol / chloroform extractie.
- Na de tweede extractie neerslag van de RNA door het toevoegen van 2.7x volumes ethanol en centrifugeren bij 18.600 RFC gedurende 30 minuten bij 4 ° C.
- Resuspendeer RNA pellets in lysisbuffer oplossing en vervolgens neerslaan met ethanol een tweede keer.
- Ten slotte is resuspendeer de RNA in een oplossing van 10 mM acetaat gebufferde (pH 4,5) en 1 mM EDTA voor verdere behandeling. Het monster kan stabiel bewaard worden bij -80 ° C gedurende ongeveer twee weken. Langere opslag is niet aan te raden aangezien sommige geladen tRNA zal beginnen te deacylate.
Deel 2: Bereiding van tRNA Standards
- Warmte E. coli tRNA normen op 10,5 uM tot 85 ° C in 45 mM Tris-Cl pH 7,5 gedurende 2 minuten. Neem de buis uit en laat op kamertemperatuur gedurende 3 minuten.
- Voeg MgCl 2 tot een uiteindelijke concentratie van 20 mM en incubeer bij 37 ° C gedurende 5 minuten.
- Voeg de synthetase reactiemengsel zodat de uiteindelijke reactie bevat 5 uM tRNA, 60 mM Tris-HCl (pH 7,5), 12,5 mM MgCl2, 10 mM KCl, 3 mM dithiothreitol, 1,5 mM ATP, 1 mM spermine, 1 mM van de respectieve aminozuur, en 4,2 eenheden / ul E. coli aminoacyl-tRNA synthetase mix. Incubeer bij 37 ° C gedurende 15 minuten.
- Voeg een gelijk volume van 0,5 M acetaat gebufferde (pH 4,5) en extract met een acetaat-verzadigde fenol / CHCl 3 bij pH 4,5.
- Neerslaan van de tRNA-normen met 2.7x volumes ethanol en centrifugeren bij 18.600 RFC gedurende 30 minuten bij 4 ° C.
- Resuspendeer de normen in 50 mM acetaat gebufferde (pH 4,5) met 1 mM EDTA en bewaar bij -80 ° C tot maximaal een maand.
Deel 3: Cy3/Cy5 etikettering van tRNA
- Voor de geladen tRNA monster incubeer totaal RNA bij een concentratie van 0,1 pg / pl met 0,066 uM elk E. coli tRNA normen (dat wil zeggen 0,67 pmol elke standaard per microgram totaal RNA) en 100 mM acetaat gebufferde (pH 4,5) in de aanwezigheid van 50 mM NaIO4 gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Voor de controle totaal tRNA voorbeeld van het gebruik 50 mM NaCl in plaats van NaIO4. Vergeet niet om de RNA verdunnen alleen met gebufferde oplossingen voor behoud van het opladen.
- Om doven de reactie toe te voegen glucose tot 100 mm en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
- Om alle resterende NaIO4 verwijderen uit de steekproef uitvoeren van een buffer uitwisseling met behulp van een G25 draaien kolom. Voor het beste resultaat equilibreren de kolom eerst door draaien 200 mM gebufferde acetaat buffer (pH 4.5) door het voorafgaand aan het toepassen van uw monster.
- Neerslag het monster door het toevoegen van gebufferd acetaat (pH 4,5) tot een uiteindelijke concentratie van 133 mM NaCl en tot een uiteindelijke concentratie van 66 mM en 2.7x volumes ethanol. Af en toe een seconde neerslag kan nodig zijn voor de geoxideerde monsters. Dit is alleen noodzakelijk als de pellet ziet er aanzienlijk anders uit dan de controle pellet van hetzelfde monster. Bijvoorbeeld een aanzienlijk groter of meer diffuse pellet. Als er een tweede ethanol precipitatie is vereist hersuspenderen pellet in 50 mM acetaat buffer pH 4,5 en 200 mM NaCl vóór de toevoeging van ethanol.
- Voor deacylering het tRNA monsters worden geresuspendeerd in 50 mM Tris-HCl (pH 9) en geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 30 minuten. De reactie wordt geneutraliseerd door de toevoeging van een gelijk volume van 50 mM acetaat gebufferde (pH 4,5) en 100 mM NaCl. Neerslag met een 2.7x volumes ethanol. Na precipitatie wordt RNA geresuspendeerd in water bij ~ 1 ug / ul. Zowel de controle en geoxideerde monsters moeten worden uitgevoerd op agarose gels om RNA-kwaliteit te controleren.
- Te bevestigen tl-oligo labels op het tRNA 0,1 ug / ul gedeacyleerd RNA wordt geïncubeerd in 1x ligase buffer, 15% DMSO, 4 uM Cy3-of Cy5-bevattende oligonucleotiden, 0,5 eenheden / ul T4 DNA-ligase, en gist exo-fosfatase (5000 eenheden / ul) bij 16 ° C gedurende de nacht (meer dan 16 uur). De exo-fosfatase is alleen nodig voor monsters afkomstig van gist en kan worden omitted als dit protocol wordt gebruikt voor E. coli of menselijke monsters.
- Na ligatie monsters worden gemengd met 4 delen van 50 mM KOAc (pH 7), 200 mM KCl, en daarna geëxtraheerd met een gelijk volume fenol / chloroform. Na extractie van de waterige fase, zijn de voorbereidingen RNA geprecipiteerd met ethanol en opnieuw gesuspendeerd in water tot ongeveer 0,1 pg / pl.
- Ligatie efficiëntie kan worden beoordeeld door het uitvoeren van 5-10% van de monsters die op 12% polyacrylamide gels die 7M ureum en gevisualiseerd met een fluorescerende gel scanner. Dit PAGE-analyse is ook nuttig om te bepalen van de hoeveelheid geoxideerde en controle de nodige monsters voor microarray hybridisatie. Een goede ligatie resultaat moet laten zien ~ 10% of meer van de Cy3/Cy5 met oligonucleotide wordt geligeerd aan het tRNA. Voor monsters met een goede etikettering efficiëntie, is 0.1-0.5 microgram totaal RNA per monster gebruikt voor array hybridisatie.
Deel 4: Hybridisatie en analyse van de Microarray
- Voorafgaand aan hybridisatie microarray dia's worden gekookt in gedestilleerd water gedurende 1-2 minuten om ongebonden oligonucleotiden te verwijderen.
- Cy3/Cy5 gelabelde monsters worden gecombineerd met 140 pi hybridisatiebuffer en zalm sperma DNA tot een uiteindelijke concentratie van 140 ug / ml en poly (A) tot een uiteindelijke concentratie van 70 ug / ml.
- Een hybridisatie-programma (tabel 1), wordt uitgevoerd op een reeks automatische veredelaar. Voor tRNA werk, is het ten zeerste aanbevolen dat een automatische hybridisatie machine worden gebruikt, omdat handmatige hybridisatie produceert hoge achtergrond.
- Nadat het programma is volledig handmatig te wassen de dia's met Wash 3-oplossing ten minste twee keer door zachtjes te schudden in een 50 ml conische buis gedurende 3-5 minuten.
- Dia's kunnen gedroogd worden door centrifugeren bij een lage snelheid, minder dan 200 RFC, 5-10 minuten. Het is belangrijk om de dia's te houden van het licht, omdat blootstelling aan het licht zal het bleken van de fluoroforen.
- Nadat de dia's worden gedroogd moeten ze onmiddellijk worden gescand voor optimale resultaten, indien nodig, ze kunnen worden opgeslagen voor meerdere dagen in een droge donkere plaats bij kamertemperatuur. Dia's kunnen worden gescand 2-3 keer zonder merkbare degradatie van de beeldkwaliteit.
Deel 5: representatieve resultaten
Wanneer behoorlijk geïsoleerd de totale RNA monster moet produceren een zeer schone spectrum met een OD 260: OD 280-verhouding in de buurt van 2. Er mag geen detecteerbare eiwit of fenol verontreiniging zijn. Bij het lopen op 1% agarose gels, moet een sterke tRNA band worden waargenomen met andere mogelijke nucleïnezuur bands variërend tussen organismen. Na oxidatie een schone tRNA band moet in acht worden genomen. Als een monster is merkbaar zwakker dan andere monsters of vegen wordt waargenomen, moeten de monsters niet worden gebruikt voor microarrays. Microarrays moeten hebben een zeer lage achtergrond, die is een orde van grootte lager is dan de zwakste tRNA sonde. Hoge achtergrond is meestal het gevolg van problemen tijdens het wassen stappen. Dit kan meestal worden vastgesteld door het bereiden van verse wasoplossingen en grondig wassen van alle apparatuur en leidingen voor rest-en neergeslagen SDS te verwijderen.
| Stap | Details |
| O-ring conditioning | 75 ° C, 2 min |
| Introduceer monster | 60 ° C |
| Denatureren Sample | 90 ° C, 5 min |
| Hybridisatie | 60 ° C, 16 uur |
| Was een | 50 ° C, debiet 10s 20s houden |
| Was 2 | 42 ° C, debiet 10s 20s houden |
| Was 3 | 42 ° C, debiet 10s 20s houden |
Tabel 1: hybridisatie protocol
Discussion
We presenteren een methode om tegelijkertijd het bepalen van de relatieve opladen niveaus van alle tRNA's op de genomische schaal. Het protocol hier gepresenteerde is geoptimaliseerd voor S. cerevisiae, en het heeft ook met succes gebruikt voor het tRNA laadprofielen te meten in E. coli en menselijke celculturen. Het kan worden aangepast aan ieder organisme met bekende genoom sequenties (waardoor annotatie van alle tRNA genen), zolang huisvesten als de totale rekening gebracht tRNA kan worden verkregen.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De gist werk in de Pan lab werd gefinancierd door een subsidie van Ajinomoto, Inc Japan en de National Institutes of Health Training Grant T32GM007183-33. Wij danken dr. Ronald Wek aan de Indiana University School of Medicine voor de lange termijn samenwerking op het gist projecten. We danken ook dr. Kimberly Dittmar voor het ontwikkelen van het tRNA opladen microarray methode.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microspin G-25 columns | GE Healthcare | 25-5325-01 | |
| E. coli tRNAPhe | Sigma-Aldrich | R3143 | |
| E. coli tRNATyr | Sigma-Aldrich | R0258 | |
| E. coli tRNALys | Sigma-Aldrich | R6018 | |
| E. coli aminoacyl-tRNA synthetases | Sigma-Aldrich | A3646 | |
| T4 DNA ligase | USB Corp., Affymetrix | 70042X | |
| PerfectHyb Plus | Sigma-Aldrich | H-7033 | |
| Hyb4 station | Digilab | ||
| GenePix 4000B scanner | Axon instruments | ||
| GenePix 6.0 | Axon instruments |
References
- Zaborske, J. M. Genome-wide analysis of tRNA charging and activation of the eIF2 kinase Gcn2p. J Biol Chem. 284 (37), 25254-25267 (2009).
- Wek, S. A., Zhu, S., Wek, R. C. The histidyl-tRNA synthetase-related sequence in the eIF-2 alpha protein kinase GCN2 interacts with tRNA and is required for activation in response to starvation for different amino acids. Mol Cell Biol. , 4497-4506 (1995).
- Hinnebusch, A. G. Translational Regulation of GCN4 and the General Amino Acid Control of Yeast. Annual Review of Microbiology. 59 (1), 407-450 (2005).
- Braeken, K. New horizons for (p)ppGpp in bacterial and plant physiology. Trends in Microbiology. 14 (1), 45-54 (2006).
- Dong, J. Uncharged tRNA Activates GCN2 by Displacing the Protein Kinase Moiety from a Bipartite tRNA-Binding Domain. Molecular Cell. 6 (2), 269-279 (2000).
- Cashel, M. The Stringent Response. Escherichia coli and Salmonella: cellular and molecular biology. Neidhardt, F. C. , ASM Press. Washington DC. 1458-1496 (1996).
- Dittmar, K. A. Selective charging of tRNA isoacceptors induced by amino-acid starvation. EMBO Rep. 6 (2), 151-157 (2005).
- Zhou, Y. High levels of tRNA abundance and alteration of tRNA charging by bortezomib in multiple myeloma. Biochem Biophys Res Commun. 385 (2), 160-164 (2009).
