Summary
Hier beschrijven we een magnetische scheidings-geassisteerde homogenisatiemethode met hoge snelheid voor grootschalige productie van endosoom-afgeleide nanovesikels als een nieuw type exosoomnabootsers (EM's) die dezelfde biologische oorsprong en vergelijkbare structuur, morfologie en eiwitsamenstelling van inheemse extracellulaire blaasjes (EV's) delen.
Abstract
Extracellulaire blaasjes (EV's) hebben veel aandacht getrokken in fysiologisch en pathologisch onderzoek, ziektediagnose en behandeling; Hun klinische vertaling is echter beperkt door het gebrek aan opschalingsbenaderingen. Daarom biedt dit protocol een magnetische scheidings-geassisteerde homogenisatiemethode met hoge snelheid voor de grootschalige productie van endosoom-afgeleide nanovesikels als een nieuw type exosoomnabootsers (EM's) afgeleid van de endosomen, die ongeveer 100 keer hogere opbrengst hebben dan conventionele ultracentrifugatiemethode. Bij deze methode werden magnetische nanodeeltjes (MNP's) geïnternaliseerd door oudercellen via endocytose en vervolgens geaccumuleerd in hun endosomen. Vervolgens werden met MNP's geladen endosomen verzameld en gezuiverd door hypotone behandeling en magnetische scheiding. Een hogesnelheidshomogenisator werd gebruikt om MNP-geladen endosomen te breken in monodisperse nanovesikels. De resulterende endosoom-afgeleide blaasjes hebben dezelfde biologische oorsprong en structuur, gekenmerkt door nanodeeltjesvolganalyse, transmissie-elektronenmicroscoop en westernvlekken. Hun morfologie en eiwitsamenstelling zijn vergelijkbaar met native EV's, wat aangeeft dat EM's mogelijk kunnen dienen als een goedkoop en hoogrenderend surrogaat van native EV's voor klinische vertalingen.
Introduction
Extracellulaire blaasjes (EV's) zijn kleine blaasjes die door bijna alle cellen worden uitgescheiden met een groottebereik van 30-150 nm en die overvloedige bioactieve stoffen bevatten. Afhankelijk van de cel van oorsprong vertonen EV's een hoge heterogeniteit, met meerdere componenten die specifiek zijn voor oudercellen1. EV's komen vrij in lichaamsvloeistoffen en worden naar verre locaties getransporteerd waar ze door doelcellen worden opgenomen voor actie2, die kan worden gebruikt om een breed scala aan bioactieve moleculen en medicijnen af te leveren voor weefselherstel, tumordiagnose en -behandeling en immuunmodulatie 3,4. Andere biologische nanodeeltjes (bijv. lipoproteïnen) en nanovesikels (bijv. EV's afgeleid van niet-endosomale routes) met vergelijkbare biofysische eigenschappen in lichaamsvloeistoffen beïnvloeden echter onvermijdelijk de isolatie en zuivering van EV. Tot op heden blijft ultracentrifugatie de gouden standaard voor EV-isolatie en zijn er andere isolatiemethodenontwikkeld, waaronder centrifugatie met sucrosedichtheidsgradiënt, ultrafiltratie, polyethyleenglycolprecipitatie, chromatografie en isolatie van immunomagnetische parels5. Het huidige knelpunt dat de klinische vertaling en commercialisering van EV-therapieën beperkt, is het ernstige gebrek aan isolatietechnieken die een zeer schaalbare en reproduceerbare isolatie van EV's mogelijk maken 6,7,8. Traditionele EV-isolatietechnieken (bijv. ultracentrifugatie en grootte-uitsluitingschromatografie) hebben te kampen met een laag rendement (1 x 107-1 x 108/1 x 10 6 cellen), een lange productiecyclus (24-48 uur), een slechte reproduceerbaarheid van de productkwaliteit en vereisen dure en energie-intensieve productieapparatuur die niet kan voldoen aan de huidige klinische vraag naar EV's6.
Exosoomnabootsers (EM's), synthetische surrogaten van native EV's, hebben belangrijke aandacht getrokken vanwege hun zeer vergelijkbare structuur, functie en schaalbaarheid in de productie. De belangrijkste bron van EM's is de directe extrusie van hele oudercellen met continue doorsnede9,10, wat krachtige biologische functies aantoont als native EV's11,12. EM's afgeleid van mesenchymale stamcellen van de menselijke navelstreng (hUCMSC's) oefenen bijvoorbeeld vergelijkbare wondgenezende effecten uit als native EV's en zijn rijker aan eiwitsamenstelling13. Hoewel EM's afkomstig van hele cellen de biologische complexiteit van EV's hebben, is hun belangrijkste nadeel de heterogeniteit van producten omdat ze onvermijdelijk besmet zijn door verschillende cellulaire organellen en celresten. Eiwitlokalisatieanalyse toonde verder aan dat EM's afgeleid van extrusie van hele cellen veel niet-EVs-specifieke eiwitten uit mitochondriën en het endoplasmatisch reticulumbevatten 13. Bovendien vereisen de meeste methoden voor de productie van EM's nog steeds ultracentrifugatie, een zeer tijdrovend en energieverslindend proces14. Gezien het feit dat exosomen uitsluitend zijn afgeleid van cellulaire endosomen, veronderstelden we dat bio-gemanipuleerde endosoom-afgeleide nanovesikels de biologische homologie tussen exosomen en EM's beter kunnen samenvatten in vergelijking met de gevestigde celmembraan-afgeleide EM's geproduceerd door extrusiemethode van hele cellen14. Desalniettemin is de productie van van endosoom afgeleide nanoblaasjes moeilijk vanwege het gebrek aan levensvatbare benaderingen.
Klinische studies zijn uitgevoerd door EV's te gebruiken als surrogaat van celvrije therapie en een medicijnafgiftesysteem op nanoschaal voor de behandeling van verschillende ziekten. EV's afgeleid van mesenchymale stamcellen in het beenmerg zijn bijvoorbeeld gebruikt om ernstige longontsteking veroorzaakt door COVID-19 te behandelen en hebben veelbelovende resultaten opgeleverd. Onlangs hebben genetisch gemanipuleerde EV's met CD24-eiwitten ook krachtige therapeutische voordelen aangetoond voor de behandeling van COVID-19-patiënten15,16. Aan de klinische eis van EV-therapie kan echter nog steeds niet worden voldaan met traditionele isolatiemethoden vanwege de lage opbrengst en kosten. Deze studie rapporteert de grootschalige productie van endosoom-afgeleide nanovesikels via een magnetische scheiding-geassisteerde high-speed homogenisatiebenadering. Het maakt gebruik van de endocytoseroute van MNP's om MNP-geladen endosomen te isoleren via magnetische scheiding, gevolgd door homogenisatie met hoge snelheid om endosomen te formuleren in monodisperse nanovesikels. Aangezien de soorten endosomen die door dit protocol worden verzameld divers zijn, is verder diepgaand onderzoek nog steeds nodig om goede productiepraktijken (GMP) in de industrie vast te stellen. Deze nieuwe EM-voorbereidingsaanpak is tijdbesparender (5 minuten homogenisatie op hoge snelheid) om nanoblaasjes te verkrijgen die homoloog zijn aan native EV's. Het produceert exponentieel meer blaasjes uit dezelfde hoeveelheden cellen dan ultracentrifugatie, die over het algemeen op verschillende celtypen kan worden toegepast.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Een schema van de methode is weergegeven in figuur 1.
1. EM-voorbereiding en isolatie
- Celinternalisatie van MNP's
- Celkweek
- Suspendeer 1 × 106 mesenchymale stamcellen van het beenmerg van ratten (BMSC), 293T-cellen of eierstokepitheelkankercellen van muizen (ID8) in DMEM compleet medium met 10% foetaal runderserum (FBS) en 5% penicilline-streptomycine-oplossing (P/S) in 2 ml per plaat met zes putjes (zie materiaaltabel).
- Kweek de cellen 's nachts bij 37 °C en 5% CO2 .
OPMERKING: Het aantal cellen na hechting was ongeveer 1 × 106.
- Endocytose van MNP's
- Verminder het gemiddelde volume van elke plaat met zes putjes tot 1 ml. Kweek de cellen samen met 10 nm polylysine-gemodificeerde ijzeroxide-nanodeeltjes (IONP's) (zie materiaaltabel) in een concentratie van 100 μg/1 × 106 cellen en incubeer bij 37 °C in een atmosfeer die 5% CO2 bevat gedurende 12 uur om de cellen in staat te stellen IONP's volledig te endocytoseren.
- Celkweek
- Isolatie en homogenisatie van endosomen
- Cel hypotone behandeling
- Verteer de cellen die volledig geïnternaliseerde IONP's hebben met 0,5 ml/putje trypsine gedurende 3 minuten, en beëindig de vertering door 1 ml/putje compleet medium toe te voegen.
- Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 1000 x g en gooi het supernatant weg. Resuspendeer de cellen in fosfaatbufferzoutoplossing (PBS) en centrifugeer, twee keer herhaaldelijk om het resterende medium en de niet-geabsorbeerde IONP's uit te spoelen.
- Resuspendeer ten slotte de pellet in 8 ml in een vooraf bereide hypotone oplossing (71,4 mM kaliumchloride, 1,3 mM natriumcitraat, pH 7,2-7,4) gedurende 15 minuten (zie Materiaaltabel).
- Vrijkomen van organellen door homogenisatie met lage snelheid
- Breng de celsuspensie in hypotone oplossing over in een glazen reageerbuis en laat de organellen los met behulp van een glashomogenisator (zie Materiaaltabel) met 20 schokken bij 1000 tpm.
- Magnetische scheiding om endosomen te verkrijgen
- Breng 1 ml van de gehomogeniseerde celoplossing over in een microcentrifugebuis van 1,5 ml en plaats deze gedurende 1 uur in een magnetische scheider om IONP-geladen endosomen volledig te scheiden van andere organellen (zoals kern en mitochondriën) en celresten.
- Verzamel de bruine korrels op het contactoppervlak van de microcentrifugebuisjes naast het magnetische frame (zie Materiaaltabel), d.w.z. de IONP-geladen endosomen. Gooi de vloeistof weg in de microcentrifugebuisjes en voeg 3 ml PBS toe om de endosomen te resuspenderen.
- Cel hypotone behandeling
- Homogenisatie op hoge snelheid
- Breng de oplossing met de endosomen over in een centrifugebuis van 15 ml met een vloeistofvolume tussen 3-10 ml.
- Verleng de 10 mm-sonde van de hogesnelheidshomogenisator (zie Materiaaltabel) naar de bodem van de centrifugebuis zonder de bodem aan te raken. Pas de snelheidsknop onder het scherm aan, stel de snelheid in op 140 x g en pas de tijdknop aan om de tijd van 5 minuten in te stellen en druk vervolgens op de OK-knop .
- Druk op de Start-knop om de homogenisatie uit te voeren nadat u een ijskast onder het monster hebt geplaatst.
- Magnetisch sorteren voor EM's
- Breng de oplossing met nanoblaasjes verkregen door homogenisatie met hoge snelheid over in de microcentrifugebuis van 1,5 ml en plaats deze gedurende 1 uur in een magnetische scheider.
- Verzamel de vloeistof die de vereiste EM's bevat. Pas op dat u het oppervlak van de buizen naast het magnetische frame niet aanraakt, die vrije IONP's en IONP-geladen EM's adsorbeerden.
2. EM-karakterisering (Figuur 2 en Figuur 3)
- Analyse van dynamische lichtverstrooiing (DLS)
- Injecteer 1 ml EMs-monster (20 μg/ml) langs de wand in de cuvet en plaats het in de monstersleuf van het instrument van het DLS-instrument (zie Materiaaltabel).
- Open de DLS-software, selecteer Deeltjesgroottetest en begin met testen.
- Meet de eiwitconcentratie met behulp van een BCA-eiwittestkit (zie Materiaaltabel).
- Analyse van het volgen van nanodeeltjes (NTA)
- Verdun EM's met PBS tot een oplossing van 1 × 107-1 × 108 deeltjes/ml en injecteer ze in de kamer van het NTA-instrument (zie materiaaltabel) met behulp van een spuit van 1 ml met een stroomsnelheid van 500-1000 μl/min.
- Open de 488 laserkanalen en zorg ervoor dat het aantal EM's in de software-interface tussen 100-300 en in Brownse beweging ligt.
- Selecteer volgens het protocol van de fabrikant de juiste SOP (EV-488) om er zeker van te zijn dat de gevoeligheid van het instrument geschikt is voor EM-detectie.
- Transmissie elektronenmicroscopie (TEM)
- Fixeer EM's (1 mg/ml) met een gelijk volume van 5% glutaaraldehyde gedurende 30 minuten en kwantificeer de concentratie EM's als 1 mg/ml met behulp van een BCA-eiwittestkit.
- Plaats een druppel EM's van 10 μl op de koolstofzijde van het koperen gaas en verwijder overtollige vloeistof van de zijkant met filtreerpapier na 10 minuten. Voeg 10 μL PBS toe en dep onmiddellijk met filtreerpapier. Herhaal dit twee keer om overtollig glutaaraldehyde te verwijderen.
- Laat 5 μL uranylacetaat-contrastmiddel vallen en kleur het gedurende 1 minuut negatief, verwijder vervolgens het overtollige contrastmiddel. Driemaal wassen met gedeïoniseerd water en drogen bij kamertemperatuur (RT).
- Opname van beeld door een TEM bij een versnellingsspanning van 100 kV.
- Western blotting
- Voeg 100 μL cellysebuffer en 5 μL van een 50x proteaseremmerscocktail toe aan de monsters (zie Materiaaltabel). Meng voorzichtig met een pipetpistool en zet 30 minuten op ijs.
- Centrifugeer de oplossing bij 1000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C, kwantificeer de eiwitconcentratie van het supernatans met een BCA-eiwittestkit en vang deze op.
- Meng het supernatans van 100 μl met 25 μl 5x eiwitlaadbuffer en verwarm gedurende 10 minuten op 95 °C.
- Bereid gels voor volgens de instructies van de voorgevormde gels. Laad 15 μg eiwit per putje en voer het uit door middel van gelelektroforese bij 80 V. Wacht tot het monster naar de scheidingsgel loopt, verander naar 100 V en breng het eiwit vervolgens over naar een nitrocellulosemembraan bij 100 V, 60 minuten onder een ijsbad.
- Detecteer de niet-EV-specifieke markers (Calnexin) en EV-biomarkers (Annexin en CD63) door middel van western blotting (zie Tabel met materialen).
OPMERKING: De antilichamen worden verdund volgens de aanbevelingen van de fabrikant.
3. In vitro EM-functiedetectie
- Etikettering van opkomende markten
- Meng 1 μL PKH26 met 250 μL verdunningsmiddel C (1:250) tot 2x kleuroplossing (4 × 10-6 M) (zie Materiaaltabel).
- Meng 250 μL EM's (1 mg/ml) met 250 μL 2x kleuroplossing en blaas snel met een pipetteerpistool.
- Incubeer 2-5 minuten bij RT terwijl u de centrifugebuis voorzichtig omkeert.
- Voeg een gelijk volume serum of 1% runderserumeiwit toe en incubeer gedurende 1 minuut om de spijsvertering te beëindigen.
- Verwijder overtollig PKH26 door ultrafiltratie met 1000 KD ultrafiltratiebuizen bij 3000 x g gedurende 30 min, en herhaal dit drie keer door PBS toe te voegen. Resuspendeer de resterende vloeistof tot 500 μL met PBS en filtreer door een filter van 0,22 μm.
- Celopnametest
- Celinoculatie: Zaad 1 × 106 cellen in confocale schaaltjes van 35 mm met 1 ml DMEM met 10% FBS en 5% P/S, en incubeer bij 37 °C en 5% CO2 gedurende de nacht.
- Filter de EM's met 0,22 μm steriele spuitfilters om mogelijke besmetting te verwijderen.
- Behandel de cellen met PKH26-gelabelde EM's (109 deeltjes/ml) gedurende 8 uur.
- Was driemaal met PBS, voeg DAPI (10 ng/ml) toe en incubeer gedurende 10 minuten bij RT.
- Verkrijg de fluorescentiebeelden in confocale laserscanning fluorescentiemicroscopie met behulp van de 405 nm en 561 nm laserkanalen (zie Tabel met materialen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De workflow van EM-bereiding door magnetische scheiding met behulp van homogenisatie met hoge snelheid wordt weergegeven in figuur 1. Cellen internaliseren 10 nm polylysine-gemodificeerde IONP's, die specifiek worden geaccumuleerd in endosomen via endocytose (Figuur 3A). Na te zijn behandeld met hypotone buffer en gehomogeniseerd, worden de IONP-geladen endosomen uit de cellen vrijgegeven en vervolgens verzameld door magnetische scheiding. De geïsoleerde endosomen worden verder gereconstitueerd tot monodisperse nanovesikels, ook bekend als EM's, door homogenisatie met hoge snelheid. We onderzochten meerdere belangrijke parameters (bijv. homogenisatiesnelheid en -tijd) om geoptimaliseerde EM-voorbereidingsomstandigheden te identificeren (Figuur 2). Ten slotte werd een homogenisatiesnelheid van 140 x g gedurende 5 minuten gekozen als de geoptimaliseerde toestand door rekening te houden met de deeltjesgrootte en het rendement van geproduceerde EM's. Vrije IONP's en IONP-geladen EM's worden uiteindelijk uit de eindproductoplossing verwijderd door een tweede ronde van magnetische scheiding om IONP-vrije EM's te verkrijgen. De methode produceert zeer uniforme en monodispergeerde nanovesikels uit oudercel-endosomen, die dezelfde biologische oorsprong delen als inheemse EV's.
Om EV's verkregen door ultracentrifugatie te vergelijken met EM's gegenereerd door deze methode, werden BMSC en 293T voorbereid voor EV's en EM's. De diameter en morfologie van EM's werden geanalyseerd door NTA en TEM. De morfologie van BMSC-EM's heeft het kenmerk van een typische komvormige blaasjesachtige structuur en wordt begrensd door een lipidedubbellaag (figuur 3A). Zoals geanalyseerd door NTA, hebben zowel BMSC-EM's als 293T-EM's een vergelijkbare hydrodynamische diameter als native EV's (BMSC-EV's en 293T-EV's) (Figuur 3B). De BMSC-EM's opbrengsten van homogenisatie op hoge snelheid waren 8,16 × 10 8-1,42 × 109/1 × 10 6 cellen, en de opbrengst van native EV's bereid door ultracentrifugatie was slechts 7,2 × 10 7-1,12 × 108/1 × 106cellen. Evenzo waren de 293T-EM's opbrengsten van homogenisatie op hoge snelheid 3,71 × 10 8-7,58 × 108/1 × 10 6 cellen, wat tot ongeveer 100 keer hoger is dan die van native 293T-EV's bereid met de conventionele ultracentrifugemethode (≈5,5 × 10 6/1 × 10 6cellen) (Figuur 4A).
Bovendien toonden de resultaten van western blotting aan dat BMSC-EM's dezelfde eiwitbiomarkers bevatten als EV's (CD63 en Annexin). Zowel EM's als EV's zijn negatief voor Calnexine-expressie, wat suggereert dat EM's die met deze methode worden geproduceerd, bijna geen plasmamembraanverontreiniging hadden (Figuur 3C). Er is geen significant verschil in eiwitconcentratie tussen EM en EV, BMSC-EM's en BMSC-EV's vertoonden vergelijkbare totale eiwitconcentraties, 11,15 μg/1 × 10 9 deeltjes en 14,71 μg/1 × 109 deeltjes via de BCA-eiwittestkit. Bovendien vertoonden 293T-EM's en 293T-EV's totale eiwitconcentraties van respectievelijk ongeveer 31,8 μg/1 × 10 9 deeltjes en 9,95 μg/1 × 109 deeltjes (figuur 4B). Deze resultaten geven aan dat EM's een vergelijkbare eiwitsamenstelling hebben als native EV's. Om te detecteren of EM's kunnen worden endocytose, werden PKH26-gelabelde EM's en EV's samen geïncubeerd met BMSC en ID8 in een concentratie van 1 × 109 deeltjes/ml gedurende 8 uur, en de cellen werden geobserveerd onder confocale fluorescentiemicroscopie om te bevestigen dat EM's gemakkelijk door de cellen konden worden opgenomen voor actie, evenals EV's (Figuur 5).
Figuur 1: Schematisch diagram van de magnetisch ondersteunde homogenisatiemethode met hoge snelheid. Stap 1: Cellen internaliseren IONP's in endosomen door middel van endocytose. Stap 2: Verzamel organellen, inclusief IONP-geladen endosomen, na hypotone behandeling en homogenisatie. Stap 3: Zuiver IONP-geladen endosomen door magnetische scheiding. Stap 4: De endosomen worden gehomogeniseerd en gereconstitueerd tot monodisperse nanovesikels. Stap 5: Verwijder vrije IONP's en IONP-geladen EM's door magnetische scheiding om IONP-vrije EM's te verzamelen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: De optimalisatie van EM-voorbereidingscondities . (A) De diameter en PDI van BMSC-EM's als reactie op veranderingen in de homogenisatiesnelheid wanneer de tijd is ingesteld op 5 minuten werden geanalyseerd door DLS. (B) De diameter en PDI van BMSC-EM's als reactie op veranderingen in de homogenisatietijd wanneer de homogenisatiesnelheid wordt ingesteld op 140 x g werden geanalyseerd door DLS. (C) De diameter en PDI van BMSC-EM's op verschillende opslagtijdstippen werden geanalyseerd door DLS. (D) De diameter en concentratie van BMSC-EM's als reactie op veranderingen in de homogenisatiesnelheid wanneer de tijd is ingesteld op 5 minuten werden geanalyseerd door NTA. (E) De diameter en concentratie van BMSC-EM's als reactie op de verandering van de homogenisatietijd wanneer de homogenisatiesnelheid is ingesteld op 140 x g werden geanalyseerd door NTA. (F) De diameter en opbrengst van BMSC-EM's als reactie op co-incubatie van BMSC-cellen met IONP's van verschillende concentraties werden geanalyseerd door NTA. p < 0,0001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Karakterisering van EM's. (A) TEM-karakterisering van de morfologie van oudercellen met endocytose IONP's, endosomen en EM's. De schaalbalken vertegenwoordigen 500 nm. (B) Hydrodynamische diameters van BMSC-EM, BMSC-EV, 293T-EM en 293T-EV worden gekenmerkt door NTA. (C) Western blot-analyseresultaten van BMSC-EM's, BMSC-EV's en BMSC-cellysaten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: De opbrengst van EM's is hoger dan die van EV's. (A) De opbrengst van EM's en EV's bereid uit BMSC en 293T werd geanalyseerd door NTA. (B) Eiwitopbrengst van EM's en EV's bereid uit BMSC en 293T. **p < 0,01. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Representatieve fluorescentiemicroscoopbeelden van PKH26-gelabelde EV's en EM's geïnternaliseerd door BMSC en ID8. De schaalbalken vertegenwoordigen 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Als surrogaat van celvrije therapie en een medicijnafgiftesysteem op nanoschaal moeten EV's nog aan hun klinische verwachtingen voldoen, en een belangrijk obstakel is het gebrek aan schaalbare en reproduceerbare productie- en zuiveringsmethoden6. Daarom zijn er verschillende soorten EM's ontwikkeld als EV-analogen met een vergelijkbare biologische complexiteit14. Tot op heden is het meest gebruikte EM-voorbeeld celplasmamembraan-afgeleide nanovesikels. De bereiding van dergelijke nanoblaasjes is relatief eenvoudig en ongecompliceerd door hele oudercellen direct te extruderen17. Van celplasmamembraan afgeleide nanoblaasjes kunnen echter geen native EV's recapituleren vanwege twee nadelen: ten eerste is de biologische oorsprong van deze nanovesikels afkomstig van celplasmamembraan, dat verschillende lipide- en eiwitsamenstellingen bevat in vergelijking met native EV's; Ten tweede, de verontreinigingen, waaronder eiwitten, nucleïnezuren en lipiden van niet-EV-organellen en celresten, die onvermijdelijke EM-heterogeniteit veroorzaken. Bij deze methode hebben we cellen geïncubeerd met IONP's en IONP-geladen endosomen verzameld door middel van magnetische scheiding, vervolgens monodisperse nanovesikels gegenereerd via snelle homogenisatie, en uiteindelijk IONP-vrije EM's verkregen door een tweede ronde van magnetische scheiding. Bovendien optimaliseerden we de EM-bereidingscondities door de impact van verschillende parameters, zoals homogenisatiesnelheid en -tijd, op EM-grootte en -opbrengst te onderzoeken. Dit protocol maakt gebruik van een interessant biologisch fenomeen: MNP's (bijv. 10 nm IONP's) kunnen efficiënt worden geïnternaliseerd door bijna alle cellen via endocytose en uitsluitend worden geaccumuleerd in endosomen, niet in andere organellen. Dit unieke biologische proces maakte het mogelijk om MNP-geladen endosomen te isoleren zonder niet-EV-verontreinigingen via magnetische scheiding. In ruil daarvoor zouden nanovesikels bereid door deze gezuiverde celendosomen de biologische complexiteit van inheemse EV's getrouwer kunnen recapituleren.
Bovendien is de gouden standaard van de EV-isolatiemethode ultracentrifugatie, die enorme celkweekmedia en een lange verwerkingstijd van meer dan 5 uur kost en slechts 1 × 107-1 × 108 deeltjes produceert uit 1 x 10 6 cellen6. Traditionele extrusiemethoden voor hele oudercellen omvatten meerdere stappen met ultrahogedrukmembraanextrusie en ultracentrifugatie, die een relatief hogere opbrengst hebben, maar dure apparatuur vereisen17. Het rendement, de efficiëntie, de kosten en de mankracht van de EM-productie worden echter aanzienlijk verbeterd door gebruik te maken van ons protocol. De high-speed homogenisator is een veelgebruikte en goedkope apparatuur voor een korte verwerkingstijd van 5 minuten in dit protocol, en deze methode kan tot 100 keer meer EM's produceren van 1 × 106 cellen in vergelijking met native EV's. Deze methode heeft echter enkele beperkingen, zoals verlies van endosomale eiwitten tijdens snelle homogenisatie, en het is aangetoond dat MNP's die door cellen worden geëxdocytooseerd, kunnen worden overgebracht naar lysosomen, wat een potentiële besmetting zou zijn18.
In perspectief kunnen EM's worden ontworpen om belangrijke biologische functies uit te oefenen als hun oorspronkelijke tegenhangers, wat kan dienen als een nieuw en veelbelovend type biologische therapieën. Bioactieve stoffen (bijv. eiwitten en nucleïnezuren) kunnen in EM's worden geïntegreerd via het selecteren van specifieke oudercellen (bijv. stamcellen19) of genetische modificatie (bijv. fusie-eiwitten20). Zo hebben van cellen afgeleide nanoblaasjes door het extruderen van levende embryonale stamcellen een positief effect op het herstel- ofwondgenezingsproces19. Genetische modificatie is een alternatieve benadering om EM's met specifieke biologische functies te genereren. Wanneer cellen bijvoorbeeld werden getransfecteerd met vectoren van anti-epidermale groeifactorreceptor (EGFR) nanobodies die zijn gefuseerd met glycosylfosfatidylinositol (GPI) ankersignaalpeptiden, kunnen de EGFR-nanobodies worden verankerd op het oppervlak van EV's voor het richten op EGFR-expressieve tumorcellen20. EM's hebben goed gepresteerd als surrogaat van celvrije therapie en een medicijnafgiftesysteem op nanoschaal in meerdere preklinische onderzoeken14, maar er is een gebrek aan een alomvattend mechanistisch begrip van EM of op EV gebaseerde therapie met zorgen over de heterogeniteit en reproduceerbaarheid van EV's en EM's in klinische onderzoeken. Alles bij elkaar genomen rechtvaardigen de biologische functies van EM's en hun klinische implicaties verder onderzoek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
D.W. en P.G. zijn mede-uitvinders van een patentaanvraag die is ingediend door het Institute of Basic Medicine and Cancer (IBMC), Chinese Academie van Wetenschappen. De andere auteur verklaart geen belangenconflicten.
Acknowledgments
De auteurs erkennen het gebruik van instrumenten in de Shared Instrumentation Core Facility van het Institute of Basic Medicine and Cancer (IBMC), Chinese Academie van Wetenschappen. Deze studie werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (NSFC; 82172598), de Natural Science Foundation van de provincie Zhejiang, China (LZ22H310001), het 551 Health Talent Training Project van de Health Commission van de provincie Zhejiang, China, het Agricultural and Social Development Research Project van het Hangzhou Municipal Science and Technology Bureau (2022ZDSJ0474) en Qiantang Interdisciplinary Research Grant.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Annexin antibody | ABclonal | A11235 | Western blotting |
| BCA assay kit | Beyotime | P0012 | Protein concentration assay |
| Calnexin | GeneTex | HL1598 | Western blotting |
| CD63 antibody | ABclonal | A19023 | Western blotting |
| Cell lysis buffer for Western and IP | Beyotime | P0013 | Western blotting |
| Centrifuge | Beckman | Allegra X-30R | Cell centrifuge |
| CO2 incubator | Thermo | Cell culture | |
| Confocal laser scanning fluorescence microscopy | NIKON | A1 HD25 | Photo the fluorescence picture |
| DMEM basic (1x) | GIBCO | C11995500BT | Cell culture |
| Dynamic light scattering (DLS) | Malvern | Zetasizer Nano ZS ZEN3600 | Diameter analysis |
| Electric glass homogenizer | SCIENTZ(Ningbo, China) | DY89-II | Low-speed homogenization |
| Exosome-depleted FBS | system Bioscience | EXO-FBS-50A-1 | Cell culture |
| High-speed homogenizer | SCIENTZ(Ningbo, China) | XHF-DY | High-speed homogenization |
| Magnetic grate | Tuohe Electromechanical Technology (Shanghai, China) | NA | Magnetic separation |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich | PKH26GL-1KT | The kit contains PKH26 cell linker in ethanol and Diluent C |
| Polylysine-modified iron oxide nanoparticles (IONPs) | Zhongke Leiming Technology (Beijing, China) | Mag1100-10 | Cell culture |
| Potassium chloride | Aladdin | 7447-40-7 | Cell hypotonic treatment |
| Protease inhibitor cocktail | Beyotime | P1030 | Proteinase inhibitor |
| Sodium citrate | Aladdin | 7447-40-7 | Cell hypotonic treatment |
| Transmission electron microscopy (TEM) | JEOL | JEM-2100plus | Morphology image |
| Ultracentrifuge | Beckman | Optima XPN-100 | Exosome centrifuge |
| ZetaView nanoparticle tracking analyzers | Particle Metrix | PMX120 | Nanoparticle tracking analysis |
References
- Kalluri, R., LeBleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (6478), eaau6977 (2020).
- Hyenne, V., et al. RAL-1 controls multivesicular body biogenesis and exosome secretion. J Cell Biol. 211 (1), 27-37 (2015).
- Farooqi, A. A., et al. Exosome biogenesis, bioactivities and functions as new delivery systems of natural compounds. Biotechnol Adv. 36 (1), 328-334 (2018).
- Gatti, S., et al. Microvesicles derived from human adult mesenchymal stem cells protect against ischaemia-reperfusion-induced acute and chronic kidney injury. Nephrol Dial Transplant. 26 (5), 1474-1483 (2011).
- Zhang, Y., et al. Exosome: A review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications. Int J Nanomedicine. 15, 6917-6934 (2020).
- Yang, D., et al. Progress, opportunity, and perspective on exosome isolation - efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
- Castilletti, C., et al. Coordinate induction of IFN-alpha and -gamma by SARS-CoV also in the absence of virus replication. Virology. 341 (1), 163-169 (2005).
- Guo, P., Huang, J., Moses, M. A. Cancer nanomedicines in an evolving oncology landscape. Trends Pharmacol Sci. 41 (10), 730-742 (2020).
- Jo, W., et al.
- Yoon, J., et al. Generation of nanovesicles with sliced cellular membrane fragments for exogenous material delivery. Biomaterials. 59, 12-20 (2015).
- Li, M., et al. Exosome mimetics derived from bone marrow mesenchymal stem cells ablate neuroblastoma tumor in vitro and in vivo. Biomater Adv. 142, 213161 (2022).
- Wang, J., et al. Exosome mimetics derived from bone marrow mesenchymal stem cells deliver doxorubicin to osteosarcoma in vitro and in vivo. Drug Deliv. 29 (1), 3291-3303 (2022).
- Zhang, Z., et al. Comprehensive proteomic analysis of exosome mimetic vesicles and exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 312 (2022).
- Li, Y. J., et al. Artificial exosomes for translational nanomedicine. J Nanobiotechnology. 19 (1), 242 (2021).
- Yang, W., et al. Clinical characteristics of 310 SARS-CoV-2 Omicron variant patients and comparison with Delta and Beta variant patients in China. Virol Sin. 37 (5), 12 (2022).
- Shapira, S., et al. A novel platform for attenuating immune hyperactivity using EXO-CD24 in COVID-19 and beyond. EMBO Mol Med. 14 (9), 15997 (2022).
- Jang, S. C., et al. Bioinspired exosome-mimetic nanovesicles for targeted delivery of chemotherapeutics to malignant tumors. ACS Nano. 7 (9), 7698-7710 (2013).
- Le, T. S., et al. Quick and mild isolation of intact lysosomes using magnetic-plasmonic hybrid nanoparticles. ACS Nano. 16 (1), 885-896 (2022).
- Jeong, D., et al. Nanovesicles engineered from ES cells for enhanced cell proliferation. Biomaterials. 35 (34), 9302-9310 (2014).
- Kooijmans, S. A., et al. Display of GPI-anchored anti-EGFR nanobodies on extracellular vesicles promotes tumour cell targeting. J Extracell Vesicles. 5, 31053 (2016).
