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Biology

एंडोसोम-व्युत्पन्न पुटिकाओं के बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए एक चुंबकीय पृथक्करण-सहायता प्राप्त उच्च गति समरूपता विधि

Published: January 26, 2024 doi: 10.3791/66021
Automatic Translation
1,2, 2,3, 1,2,3,4
1Academy of Medical Engineering and Translational Medicine, Tianjin University, 2Hangzhou Institute of Medicine (HIM), Chinese Academy of Sciences, 3School of Materials Science and Engineering, Tianjin University, 4Zhejiang Cancer Hospital

Summary

यहां, हम एंडोसोम-व्युत्पन्न नैनोवेसिकल्स के बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए एक चुंबकीय पृथक्करण-सहायता प्राप्त उच्च गति समरूपता विधि का वर्णन एक नए प्रकार के एक्सोसोम मिमिक्स (ईएम) के रूप में करते हैं जो एक ही जैविक उत्पत्ति और समान संरचना, आकृति विज्ञान और प्रोटीन संरचना साझा करते हैं।

Abstract

बाह्य पुटिकाओं (ईवीएस) ने शारीरिक और रोग अनुसंधान, रोग निदान और उपचार में महत्वपूर्ण ध्यान आकर्षित किया है; हालांकि, उनके नैदानिक अनुवाद को स्केल-अप विनिर्माण दृष्टिकोणों की कमी से सीमित किया गया है। इसलिए, यह प्रोटोकॉल एंडोसोम से प्राप्त एक नए प्रकार के एक्सोसोम मिमिक्स (ईएम) के रूप में एंडोसोम-व्युत्पन्न नैनोवेसिकल्स के बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए एक चुंबकीय पृथक्करण-सहायता प्राप्त उच्च गति समरूपता विधि प्रदान करता है, जिसमें पारंपरिक अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन विधि की तुलना में लगभग 100 गुना अधिक उपज होती है। इस पद्धति में, चुंबकीय नैनोकणों (एमएनपी) को एंडोसाइटोसिस के माध्यम से पैतृक कोशिकाओं द्वारा आंतरिक किया गया था और बाद में उनके एंडोसोम के भीतर जमा किया गया था। फिर, एमएनपी-लोडेड एंडोसोम को हाइपोटोनिक उपचार और चुंबकीय पृथक्करण द्वारा एकत्र और शुद्ध किया गया। एमएनपी-लोडेड एंडोसोम को मोनोडिस्पर्स नैनोवेसिकल्स में तोड़ने के लिए एक उच्च गति वाले होमोजेनाइज़र का उपयोग किया गया था। परिणामी एंडोसोम-व्युत्पन्न पुटिकाओं में एक ही जैविक उत्पत्ति और संरचना होती है, जो नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण, ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप और पश्चिमी सोख्ता की विशेषता है। उनकी आकृति विज्ञान और प्रोटीन संरचना देशी ईवीएस के समान है, यह दर्शाता है कि ईएम संभावित रूप से नैदानिक अनुवाद के लिए देशी ईवीएस के कम लागत और उच्च उपज वाले सरोगेट के रूप में काम कर सकते हैं।

Introduction

एक्स्ट्रासेल्युलर वेसिकल्स (ईवीएस) 30-150 एनएम के आकार की सीमा के साथ लगभग सभी कोशिकाओं द्वारा स्रावित छोटे पुटिका होते हैं, जिनमें प्रचुर मात्रा में बायोएक्टिव पदार्थ होते हैं। उत्पत्ति की कोशिका के आधार पर, ईवीएस उच्च विषमता दिखाते हैं, जिसमें मूल कोशिकाओं के लिए विशिष्ट कई घटकहोते हैं 1. ईवीएस को शरीर के तरल पदार्थ में छोड़ा जाता है और दूर की साइटों पर ले जाया जाता है जहां उन्हें कार्रवाई2 के लिए लक्ष्य कोशिकाओं द्वारा लिया जाता है, जिसका उपयोग ऊतक की मरम्मत, ट्यूमर निदान और उपचार, और प्रतिरक्षा मॉड्यूलेशन 3,4 के लिए बायोएक्टिव अणुओं और दवाओं की एक विस्तृत श्रृंखला देने के लिए किया जा सकता है। हालांकि, शरीर के तरल पदार्थों में समान बायोफिजिकल गुणों के साथ अन्य जैविक नैनोकणों (जैसे, लिपोप्रोटीन) और नैनोवेसिकल्स (जैसे, गैर-एंडोसोमल मार्गों से प्राप्त ईवीएस) अनिवार्य रूप से ईवी अलगाव और शुद्धि को प्रभावित करते हैं। तिथि करने के लिए, ultracentrifugation ईवी अलगाव के लिए स्वर्ण मानक बनी हुई है, और अन्य अलगाव विधियों, sucrose घनत्व ढाल centrifugation, ultrafiltration, polyethylene ग्लाइकोल वर्षा, क्रोमैटोग्राफी, और immunomagnetic मनका अलगाव सहित,5 विकसित किया गया है. ईवी चिकित्सा विज्ञान के नैदानिक अनुवाद और व्यावसायीकरण को सीमित करने वाली वर्तमान अड़चन अलगाव तकनीकों की गंभीर कमी है जो ईवीएस 6,7,8 के अत्यधिक स्केलेबल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य अलगाव की अनुमति देती है। पारंपरिक ईवी अलगाव तकनीक (जैसे, अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन और आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी) कम उपज (1 x 107-1 x 108/1 x 10 6 कोशिकाओं), लंबे उत्पादन चक्र (24-48 एच), उत्पाद की गुणवत्ता की खराब प्रजनन क्षमता, और महंगी और ऊर्जा-गहन उत्पादन उपकरण की आवश्यकता होती है जो ईवीएस6 के लिए वर्तमान नैदानिक मांग को पूरा नहीं कर सकते हैं।

एक्सोसोम मिमिक्स (ईएम), देशी ईवी के सिंथेटिक सरोगेट, ने उत्पादन में उनकी अत्यधिक समान संरचना, कार्य और मापनीयता के कारण महत्वपूर्ण ध्यान आकर्षित किया है। ईएम का मुख्य स्रोत निरंतर सेक्शनिंग 9,10 के साथ पूरे पैतृक कोशिकाओं के प्रत्यक्ष एक्सट्रूज़न से है, जो देशी ईवीएस11,12 के रूप में शक्तिशाली जैविक कार्यों का प्रदर्शन करता है। उदाहरण के लिए, मानव गर्भनाल मेसेनकाइमल स्टेम सेल (hUCMSCs) से व्युत्पन्न EMs देशी EVs के रूप में इसी तरह घाव भरने प्रभाव डालती है और प्रोटीन संरचना13 में अमीर हैं. हालांकि पूरे कोशिकाओं से प्राप्त ईएम में ईवीएस की जैविक जटिलता होती है, लेकिन उनका मुख्य दोष उत्पादों की विषमता है क्योंकि वे अनिवार्य रूप से विभिन्न सेलुलर ऑर्गेनेल और सेल मलबे से दूषित होते हैं। प्रोटीन स्थानीयकरण विश्लेषण आगे पता चला है कि पूरे सेल बाहर निकालना से व्युत्पन्न ईएम माइटोकॉन्ड्रिया और एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम13 से कई गैर ईवीएस-विशिष्ट प्रोटीन होते हैं. इसके अलावा, ईएम के निर्माण के लिए अधिकांश तरीकों को अभी भी अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन, एक अत्यधिक समय और ऊर्जा लेने वाली प्रक्रिया14 की आवश्यकता होती है। तथ्य यह है कि exosomes विशेष रूप से सेलुलर endosomes से व्युत्पन्न कर रहे हैं को ध्यान में रखते हुए, हम bioengineered endosome-व्युत्पन्न nanovesicles बेहतर अच्छी तरह से स्थापित सेल झिल्ली व्युत्पन्न पूरे सेल बाहर निकालना विधि14 द्वारा उत्पादित EMs के साथ तुलना में exosomes और ईएम के बीच जैविक होमोलॉजी recapitulate हो सकता है कि परिकल्पना. फिर भी, व्यवहार्य दृष्टिकोणों की कमी के कारण एंडोसोम-व्युत्पन्न नैनोवेसिकल्स का निर्माण मुश्किल है।

विभिन्न रोगों के उपचार के लिए सेल-फ्री थेरेपी और नैनोस्केल ड्रग डिलीवरी सिस्टम के सरोगेट के रूप में ईवीएस का उपयोग करके नैदानिक अध्ययन किए गए हैं। उदाहरण के लिए, अस्थि मज्जा मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं से प्राप्त ईवीएस का उपयोग COVID-19 के कारण होने वाले गंभीर निमोनिया के इलाज के लिए किया गया है और आशाजनक परिणाम प्राप्त किए हैं। हाल ही में, सीडी 24 प्रोटीन ले जाने वाले आनुवंशिक रूप से इंजीनियर ईवी ने भी COVID-19 रोगियों के इलाज के लिए शक्तिशाली चिकित्सीय लाभ प्रदर्शित किए हैं15,16. हालांकि, कम उपज और लागत के कारण ईवी थेरेपी की नैदानिक आवश्यकता को अभी भी पारंपरिक अलगाव विधियों से पूरा नहीं किया जा सकता है। यह अध्ययन एक चुंबकीय पृथक्करण-सहायता प्राप्त उच्च गति समरूपता दृष्टिकोण के माध्यम से एंडोसोम-व्युत्पन्न नैनोवेसिकल्स के बड़े पैमाने पर उत्पादन की रिपोर्ट करता है। यह चुंबकीय पृथक्करण के माध्यम से एमएनपी-लोडेड एंडोसोम को अलग करने के लिए एमएनपी के एंडोसाइटोसिस मार्ग का लाभ उठाता है, इसके बाद मोनोडिस्पर्स नैनोवेसिकल्स में एंडोसोम तैयार करने के लिए उच्च गति समरूपता होती है। चूंकि इस प्रोटोकॉल द्वारा एकत्र किए गए एंडोसोम के प्रकार विविध हैं, इसलिए उद्योग में अच्छी विनिर्माण प्रथाओं (जीएमपी) को स्थापित करने के लिए अभी भी गहन शोध की आवश्यकता है। यह उपन्यास ईएम तैयारी दृष्टिकोण देशी ईवीएस के लिए समरूप नैनोवेसिकल्स प्राप्त करने के लिए अधिक समय कुशल (उच्च गति समरूपता के 5 मिनट) है। यह अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन की तुलना में कोशिकाओं की समान मात्रा से तेजी से अधिक पुटिकाओं का उत्पादन करता है, जिसे आम तौर पर विभिन्न सेल प्रकारों पर लागू किया जा सकता है।

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Protocol

नोट: विधि का एक योजनाबद्ध चित्रा 1 में दिखाया गया है।

1. ईएम तैयारी और अलगाव

  1. एमएनपी का सेल आंतरिककरण
    1. सेल संस्कृति
      1. निलंबित 1 × 106 चूहा अस्थि मज्जा मेसेनकाइमल स्टेम सेल (बीएमएससी), 293T कोशिकाओं, या माउस डिम्बग्रंथि उपकला कैंसर कोशिकाओं (ID8) DMEM में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 5% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन समाधान (पी / एस) के साथ 2 एमएल प्रति छह-अच्छी प्लेट ( सामग्री की तालिकादेखें)।
      2. संस्कृति 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर रातोंरात कोशिकाओं.
        नोट: पालन के बाद कोशिकाओं की संख्या 106 × लगभग 1 थी।
    2. एमएनपी का एंडोसाइटोसिस
      1. प्रत्येक छह-अच्छी प्लेट की मध्यम मात्रा को 1 एमएल तक कम करें। 100 μg/1 × 106 कोशिकाओं की एकाग्रता पर 10 एनएम पॉलीसिन-संशोधित आयरन ऑक्साइड नैनोकणों (IONPs) (सामग्री की तालिका देखें) के साथ कोशिकाओं को सह-संस्कृति करें और 12 घंटे के लिए 5% CO2 युक्त वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें ताकि कोशिकाओं को पूरी तरह से IONPs एंडोसाइटोज करने की अनुमति मिल सके।
  2. एंडोसोम का अलगाव और समरूपीकरण
    1. सेल हाइपोटोनिक उपचार
      1. कोशिकाओं है कि पूरी तरह से 3 मिनट के लिए 0.5 एमएल / अच्छी तरह से trypsin के साथ IONPs आंतरिक है पचाना, और 1 एमएल / अच्छी तरह से पूर्ण माध्यम जोड़कर पाचन समाप्त.
      2. 5 मिनट के लिए 1000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र, और सतह पर तैरनेवाला त्यागें। फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) और अपकेंद्रित्र में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें, बार-बार अवशिष्ट माध्यम और अशोषित आईओएनपी को धोने के लिए।
      3. अंत में, 15 मिनट के लिए पूर्व-तैयार हाइपोटोनिक समाधान (71.4 मिमी पोटेशियम क्लोराइड, 1.3 मिमी सोडियम साइट्रेट, पीएच 7.2-7.4) में 8 एमएल में गोली को फिर से निलंबित करें ( सामग्री की तालिकादेखें)।
    2. कम गति वाले समरूपीकरण द्वारा ऑर्गेनेल की रिहाई
      1. एक ग्लास टेस्ट ट्यूब के लिए हाइपोटोनिक समाधान में सेल निलंबन स्थानांतरण और 1000 आरपीएम पर 20 झटके से एक गिलास homogenizer ( सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग organelles रिहाई.
    3. एंडोसोम प्राप्त करने के लिए चुंबकीय पृथक्करण
      1. समरूप सेल समाधान के 1 एमएल को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और 1 घंटे के लिए चुंबकीय विभाजक में रखें ताकि आईओएनपी-लोडेड एंडोसोम को अन्य ऑर्गेनेल (जैसे नाभिक और माइटोकॉन्ड्रिया) और सेल मलबे से पूरी तरह से अलग किया जा सके।
      2. चुंबकीय फ्रेम ( सामग्री की तालिकादेखें) के बगल में माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों की संपर्क सतह पर भूरे रंग के छर्रों को इकट्ठा करें, अर्थात, आईओएनपी-लोडेड एंडोसोम। माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में तरल त्यागें और एंडोसोम को फिर से निलंबित करने के लिए पीबीएस के 3 एमएल जोड़ें।
  3. उच्च गति समरूपता
    1. एंडोसोम युक्त समाधान को 3-10 एमएल के बीच तरल मात्रा के साथ 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    2. नीचे को छूने के बिना अपकेंद्रित्र ट्यूब के नीचे तक उच्च गति होमोजेनाइज़र (सामग्री की तालिकादेखें) की 10 मिमी जांच का विस्तार करें। स्क्रीन के नीचे स्पीड बटन समायोजित करें, गति को 140 x ग्राम पर सेट करें, और 5 मिनट का समय निर्धारित करने के लिए टाइम बटन समायोजित करें, फिर ओके बटन दबाएं।
    3. नमूने के नीचे एक आइस बॉक्स रखने के बाद समरूपता को पूरा करने के लिए स्टार्ट बटन दबाएं।
  4. ईएम के लिए चुंबकीय छँटाई
    1. उच्च गति समरूपता से प्राप्त नैनोवेसिकल्स युक्त समाधान को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और इसे 1 घंटे के लिए चुंबकीय विभाजक में रखें।
    2. उस तरल को इकट्ठा करें जिसमें आवश्यक ईएम हों। सावधान रहें कि चुंबकीय फ्रेम के बगल में ट्यूबों की सतह को न छुएं, जो मुक्त आईओएनपी और आईओएनपी-लोडेड ईएम को सोख लेते हैं।

2. ईएम लक्षण वर्णन (चित्रा 2 और चित्रा 3)

  1. डायनेमिक लाइट स्कैटरिंग (DLS) विश्लेषण
    1. क्यूवेट में दीवार के साथ ईएम नमूने (20 माइक्रोग्राम/एमएल) के 1 एमएल इंजेक्ट करें और इसे डीएलएस इंस्ट्रूमेंट के इंस्ट्रूमेंट सैंपल स्लॉट में रखें ( सामग्री की तालिकादेखें)।
    2. DLS सॉफ्टवेअर उघडा, कण आकार चाचणी निवडा आणि चाचणी सुरू करा.
    3. बीसीए प्रोटीन परख किट का उपयोग करके प्रोटीन एकाग्रता को मापें ( सामग्री की तालिकादेखें)।
  2. नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण (NTA)
    1. 1 × 107-1 × 108 कणों/एमएल पर एक समाधान के लिए पीबीएस के साथ ईएम को पतला करें और उन्हें एनटीए उपकरण के कक्ष में इंजेक्ट करें ( सामग्री की तालिकादेखें) 500-1000 माइक्रोन / मिनट की प्रवाह दर पर 1 एमएल सिरिंज का उपयोग करना।
    2. 488 लेजर चैनल खोलें और सुनिश्चित करें कि सॉफ्टवेयर इंटरफेस में ईएम की संख्या 100-300 के भीतर और ब्राउनियन गति में है।
    3. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार, यह सुनिश्चित करने के लिए उपयुक्त एसओपी (ईवी -488) का चयन करें कि उपकरण की संवेदनशीलता ईएम का पता लगाने के लिए उपयुक्त है।
  3. ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम)
    1. 30 मिनट के लिए 5% ग्लूटार्डाल्डिहाइड की बराबर मात्रा के साथ ईएम (1 मिलीग्राम/एमएल) को ठीक करें, और बीसीए प्रोटीन परख किट द्वारा ईएम की एकाग्रता को 1 मिलीग्राम/एमएल के रूप में निर्धारित करें।
    2. तांबे की जाली के कार्बन पक्ष पर ईएम की 10 माइक्रोन बूंद रखें, और 10 मिनट के बाद फिल्टर पेपर के साथ पक्ष से अतिरिक्त तरल हटा दें। पीबीएस के 10 माइक्रोन जोड़ें और फिल्टर पेपर के साथ तुरंत धब्बा लगाएं। अतिरिक्त ग्लूटार्डाल्डिहाइड को हटाने के लिए दो बार दोहराएं।
    3. यूरेनिल एसीटेट कंट्रास्ट एजेंट के 5 माइक्रोन ड्रॉप करें और 1 मिन के लिए नकारात्मक रूप से दाग दें, फिर अतिरिक्त कंट्रास्ट एजेंट को हटा दें। विआयनीकृत पानी से तीन बार धोएं और कमरे के तापमान (आरटी) पर सुखाएं।
    4. 100 kV के त्वरण वोल्टेज पर एक TEM द्वारा छवि रिकॉर्ड करें।
  4. वेस्टर्न ब्लॉटिंग
    1. नमूनों में सेल लाइसिस बफर के 100 माइक्रोन और 50x प्रोटीज इनहिबिटर कॉकटेल के 5 माइक्रोन जोड़ें ( सामग्री की तालिकादेखें)। एक विंदुक बंदूक के साथ धीरे मिक्स और 30 मिनट के लिए बर्फ पर डाल दिया.
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 1000 x ग्राम पर समाधान अपकेंद्रित्र, एक बीसीए प्रोटीन परख किट के साथ सतह पर तैरनेवाला की प्रोटीन एकाग्रता यों है, और इसे इकट्ठा.
    3. 5x प्रोटीन लोडिंग बफर के 25 माइक्रोन के साथ 100 माइक्रोन सुपरनेटेंट मिलाएं और 10 मिन के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें।
    4. पूर्वनिर्मित जैल के निर्देशों के अनुसार जैल तैयार करें। अच्छी तरह से प्रति प्रोटीन के 15 माइक्रोग्राम लोड करें और 80 वी पर जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा चलाएं नमूना जुदाई जेल में चलाने के लिए प्रतीक्षा करें, 100 वी में बदलें, और फिर प्रोटीन को 100 वी, बर्फ स्नान के तहत 60 मिनट पर नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली में स्थानांतरित करें।
    5. पश्चिमी सोख्ता द्वारा गैर-ईवी-विशिष्ट मार्करों (कैलनेक्सिन) और ईवी बायोमार्कर (एनेक्सिन और सीडी 63) का पता लगाएं ( सामग्री की तालिकादेखें)।
      नोट: निर्माता की सिफारिशों के अनुसार एंटीबॉडी पतला कर रहे हैं.

3. इन विट्रो ईएम फ़ंक्शन डिटेक्शन में

  1. EMs लेबलिंग
    1. 2x धुंधला समाधान (4 × 10-6 एम) बनाने के लिए मंदक सी (1:250) के 250 माइक्रोन के साथ पीकेएच 26 के 1 माइक्रोन मिलाएं ( सामग्री की तालिकादेखें)।
    2. 2x धुंधला समाधान के 250 माइक्रोन के साथ ईएम (1 मिलीग्राम/एमएल) के 250 माइक्रोन मिलाएं और जल्दी से एक पाइपिंग बंदूक से उड़ाएं।
    3. 2-5 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं, जबकि धीरे अपकेंद्रित्र ट्यूब उलट.
    4. सीरम या 1% गोजातीय सीरम प्रोटीन की एक बराबर मात्रा जोड़ें और पाचन समाप्त करने के लिए 1 मिनट के लिए सेते हैं.
    5. 30 मिनट के लिए 3000 x ग्राम पर 1000 केडी अल्ट्राफिल्ट्रेशन ट्यूबों के साथ अल्ट्राफिल्ट्रेशन द्वारा अतिरिक्त पीकेएच 26 निकालें, और पीबीएस जोड़कर तीन बार दोहराएं। शेष तरल को पीबीएस के साथ 500 माइक्रोन पर फिर से निलंबित करें और 0.22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करें।
  2. कोशिकाएं परख को आगे बढ़ाती हैं
    1. सेल टीकाकरण: बीज 1 × 106 कोशिकाओं में 35 मिमी confocal व्यंजन DMEM के 1 एमएल के साथ 10% FBS और 5% पी / एस युक्त, और 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 रात भर में सेते हैं.
    2. संभावित संदूषण को दूर करने के लिए 0.22 माइक्रोन बाँझ सिरिंज फिल्टर के साथ ईएम फ़िल्टर करें।
    3. 8 घंटे के लिए पीकेएच 26-लेबल ईएम (109 कण / एमएल) के साथ कोशिकाओं का इलाज करें।
    4. पीबीएस के साथ तीन बार धोएं, डीएपीआई (10 एनजी/एमएल) जोड़ें, और आरटी पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    5. 405 एनएम और 561 एनएम लेजर चैनलों ( सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग कर confocal लेजर स्कैनिंग प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी में प्रतिदीप्ति छवियों को प्राप्त करें.

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Representative Results

चुंबकीय जुदाई-सहायता प्राप्त उच्च गति समरूपता द्वारा ईएम तैयारी के कार्यप्रवाह चित्रा 1 में दिखाया गया है. कोशिकाएं 10 एनएम पॉलीसिन-संशोधित आईओएनपी को आंतरिक करती हैं, जो विशेष रूप से एंडोसाइटोसिस (चित्रा 3ए)के माध्यम से एंडोसोम में जमा होती हैं। हाइपोटोनिक बफर और समरूप के साथ इलाज किए जाने के बाद, आईओएनपी-लोडेड एंडोसोम कोशिकाओं से जारी किए जाते हैं और बाद में चुंबकीय पृथक्करण द्वारा एकत्र किए जाते हैं। पृथक एंडोसोम को उच्च गति वाले समरूपीकरण द्वारा मोनोडिस्पर्स नैनोवेसिकल्स में पुनर्गठित किया जाता है, जिसे ईएम के रूप में भी जाना जाता है। हम अनुकूलित ईएम तैयारी की स्थिति (चित्रा 2) की पहचान करने के लिए कई प्रमुख मापदंडों (जैसे, homogenization गति और समय) का पता लगाया. अंत में, 5 मिनट के लिए 140 x ग्राम की एक समरूपता गति कण आकार और उत्पादित ईएम की उपज पर विचार करके अनुकूलित स्थिति के रूप में चुना गया था। नि: शुल्क आईओएनपी और आईओएनपी-लोडेड ईएम को अंततः आईओएनपी-मुक्त ईएम प्राप्त करने के लिए चुंबकीय पृथक्करण के दूसरे दौर द्वारा अंतिम उत्पाद समाधान से हटा दिया जाता है। विधि पैतृक सेल एंडोसोम से अत्यधिक समान और मोनोडिस्पर्ड नैनोवेसिकल्स का उत्पादन करती है, जो देशी ईवीएस के समान जैविक उत्पत्ति साझा करती है।

इस विधि द्वारा उत्पन्न ईएम के साथ अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा प्राप्त ईवीएस की तुलना करने के लिए, बीएमएससी और 293 टी ईवीएस और ईएम के लिए तैयार किए गए थे। ईएम के व्यास और आकृति विज्ञान का विश्लेषण एनटीए और टीईएम द्वारा किया गया था। बीएमएससी-ईएम की आकृति विज्ञान में एक विशिष्ट कटोरे के आकार की पुटिका जैसी संरचना की विशेषता है और इसे लिपिड बाइलर(चित्रा 3ए)द्वारा सीमांकित किया गया है। जैसा कि एनटीए द्वारा विश्लेषण किया गया है, बीएमएससी-ईएम और 293टी-ईएम दोनों में देशी ईवीएस (बीएमएससी-ईवीएस और 293टी-ईवीएस)(चित्रा 3बी)के समान हाइड्रोडायनामिक व्यास है। उच्च गति समरूपता की बीएमएससी-ईएम पैदावार 108-1.42 × 109/1 × 10 6 कोशिकाओं × 8.16 थी, और अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा तैयार देशी ईवीएस की उपज केवल 7.2 × 107-1.12 × 108/1 × 106कोशिकाओं थी। इसी तरह, उच्च गति समरूपता की 293T-EMs पैदावार 3.71 × 108-7.58 × 108/1 × 10 6 कोशिकाओं, जो पारंपरिक ultracentrifuge विधि (≈5.5 × 106/1 × 106 कोशिकाओं) (चित्रा 4A) द्वारा तैयार देशी 293T-EVs की तुलना में लगभग 100 गुना अधिक तक पहुँचता है.

इसके अलावा, पश्चिमी सोख्ता परिणामों से पता चला है कि बीएमएससी-ईएम में ईवीएस (सीडी 63 और एनेक्सिन) के समान प्रोटीन बायोमार्कर होते हैं। ईएम और ईवीएस दोनों कैल्नेक्सिन अभिव्यक्ति के लिए नकारात्मक हैं, यह सुझाव देते हुए कि इस विधि द्वारा उत्पादित ईएम में लगभग कोई प्लाज्मा झिल्ली संदूषण(चित्रा 3सी)नहीं था। ईएम और ईवी के बीच प्रोटीन एकाग्रता में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं है, बीएमएससी-ईएम और बीएमएससी-ईवीएस ने बीसीए प्रोटीन परख किट के माध्यम से समान कुल प्रोटीन सांद्रता, 11.15 × 10 9 कणों और 14.71 माइक्रोग्राम / 1 × 109 कणों का प्रदर्शन किया। इसके अलावा, 293T-EMs और 293T-EVs ने क्रमशः 10-9 कणों और 9.95 μg/1 ×× 10-9 कणों के लगभग 31.8 μg/110-9 कणों की कुल प्रोटीन सांद्रता का प्रदर्शन किया(चित्र 4B)। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि ईएम में देशी ईवीएस के समान प्रोटीन संरचना होती है। ईएम endocytosed किया जा सकता है कि क्या पता लगाने के लिए, PKH26 लेबल EMs और EVs 8 घंटे के लिए 1 × 109 कणों/एमएल की एकाग्रता पर BMSC और ID8 के साथ सह-ऊष्मायन थे, और कोशिकाओं को कन्फोकल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के तहत मनाया गया था पुष्टि करने के लिए कि ईएम आसानी से कार्रवाई के लिए कोशिकाओं द्वारा लिया जा सकता है के रूप में अच्छी तरह से ईवीएस(चित्रा 5).

Figure 1
चित्रा 1: चुंबकीय-सहायता प्राप्त उच्च गति समरूपता विधि का योजनाबद्ध आरेख। चरण 1: कोशिकाएं एंडोसाइटोसिस के माध्यम से आईओएनपी को एंडोसोम में आंतरिक करती हैं। चरण 2: हाइपोटोनिक उपचार और समरूपीकरण के बाद, आईओएनपी-लोडेड एंडोसोम सहित ऑर्गेनेल इकट्ठा करें। चरण 3: चुंबकीय पृथक्करण द्वारा आईओएनपी-लोडेड एंडोसोम को शुद्ध करें। चरण 4: एंडोसोम को समरूप बनाया जाता है और मोनोडिस्पर्स नैनोवेसिकल्स में पुनर्गठित किया जाता है। चरण 5: IONP-मुक्त EMs एकत्र करने के लिए चुंबकीय पृथक्करण द्वारा मुक्त IONPs और IONP-लोडेड EMs निकालें। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: ईएम तैयारी की स्थिति का अनुकूलन । (ए) 5 मिनट पर समय निर्धारित होने पर समरूपीकरण गति परिवर्तन के जवाब में बीएमएससी-ईएम के व्यास और पीडीआई का डीएलएस द्वारा विश्लेषण किया गया था। (बी) समरूपीकरण समय परिवर्तन के जवाब में बीएमएससी-ईएम के व्यास और पीडीआई का विश्लेषण डीएलएस द्वारा किया गया था । (सी) विभिन्न भंडारण समय बिंदुओं पर बीएमएससी-ईएम के व्यास और पीडीआई का डीएलएस द्वारा विश्लेषण किया गया था। (डी) 5 मिनट पर समय निर्धारित होने पर समरूपीकरण गति परिवर्तन के जवाब में बीएमएससी-ईएम का व्यास और एकाग्रता एनटीए द्वारा विश्लेषण किया गया था। (ई) होमोजेनाइजेशन समय परिवर्तन के जवाब में बीएमएससी-ईएम का व्यास और एकाग्रता जब समरूपीकरण की गति 140 x ग्राम पर सेट की जाती है, एनटीए द्वारा विश्लेषण किया गया था। (एफ) बीएमएससी-ईएम के व्यास और उपज का विश्लेषण विभिन्न सांद्रता के आईओएनपी के साथ बीएमएससी कोशिकाओं के सह-इनक्यूबेशन के जवाब में एनटीए द्वारा किया गया था। पी < 0.0001। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: ईएम की विशेषता। (ए) एंडोसाइटोस्ड आईओएनपी, एंडोसोम और ईएम के साथ पैतृक कोशिकाओं की आकृति विज्ञान का टीईएम लक्षण वर्णन। स्केल बार 500 एनएम का प्रतिनिधित्व करते हैं। (बी) बीएमएससी-ईएम, बीएमएससी-ईवी, 293टी-ईएम और 293टी-ईवी के हाइड्रोडायनामिक व्यास एनटीए द्वारा विशेषता हैं। (सी) बीएमएससी-ईएम, बीएमएससी-ईवीएस और बीएमएससी सेल लाइसेट्स के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण परिणाम। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: ईएम की उपज ईवीएस से अधिक है। (ए) बीएमएससी और 293 टी से तैयार ईएम और ईवी की उपज का विश्लेषण एनटीए द्वारा किया गया था। (ख) बीएमएससी और 293टी से तैयार ईएम और ईवीएस की प्रोटीन उपज। **पी < 0.01. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: बीएमएससी और आईडी 8 द्वारा आंतरिक पीकेएच 26-लेबल ईवीएस और ईएम की प्रतिनिधि फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप छवियां। स्केल बार 10 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

सेल-फ्री थेरेपी और एक नैनोस्केल ड्रग डिलीवरी सिस्टम के सरोगेट के रूप में, ईवीएस ने अभी तक अपनी नैदानिक अपेक्षाओं को पूरा नहीं किया है, और एक मुख्य बाधा स्केलेबल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य उत्पादन और शुद्धिकरणविधियों की कमी है। इसलिए, विभिन्न प्रकार के ईएम को समान जैविक जटिलता14के साथ ईवी एनालॉग के रूप में विकसित किया गया है। तिथि करने के लिए, सबसे अधिक इस्तेमाल किया ईएम उदाहरण सेल प्लाज्मा झिल्ली व्युत्पन्न nanovesicles है. इस तरह के nanovesicles की तैयारी सीधे पूरे मूल कोशिकाओं17 बाहर निकालना द्वारा अपेक्षाकृत आसान और सीधा है. हालांकि, सेल प्लाज्मा झिल्ली-व्युत्पन्न नैनोवेसिकल्स दो कमियों के कारण देशी ईवीएस को पुन: व्यवस्थित नहीं कर सकते हैं: सबसे पहले, इन नैनोवेसिकल्स की जैविक उत्पत्ति सेल प्लाज्मा झिल्ली से होती है, जिसमें देशी ईवीएस की तुलना में विभिन्न लिपिड और प्रोटीन रचनाएं होती हैं; दूसरा, गैर-ईवी ऑर्गेनेल और सेल मलबे से प्रोटीन, न्यूक्लिक एसिड और लिपिड सहित संदूषण, अपरिहार्य ईएम विषमता का कारण बनता है। इस पद्धति में, हमने आईओएनपी के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट किया और चुंबकीय पृथक्करण के माध्यम से आईओएनपी-लोडेड एंडोसोम एकत्र किए, फिर उच्च गति समरूपता के माध्यम से मोनोडिस्पर्स नैनोवेसिकल्स उत्पन्न किए, अंततः चुंबकीय पृथक्करण के दूसरे दौर द्वारा आईओएनपी-मुक्त ईएम प्राप्त किया। इसके अलावा, हम ईएम आकार और उपज पर homogenization गति और समय के रूप में विभिन्न मापदंडों के प्रभाव की खोज करके ईएम तैयारी की स्थिति अनुकूलित. यह प्रोटोकॉल एक दिलचस्प जैविक घटना का लाभ उठाता है: एमएनपी (जैसे, 10 एनएम आईओएनपी) को एंडोसाइटोसिस के माध्यम से लगभग सभी कोशिकाओं द्वारा कुशलतापूर्वक आंतरिक किया जा सकता है और विशेष रूप से एंडोसोम में जमा किया जा सकता है, अन्य ऑर्गेनेल नहीं। इस अनूठी जैविक प्रक्रिया ने चुंबकीय पृथक्करण के माध्यम से गैर-ईवी संदूषण के बिना एमएनपी-लोडेड एंडोसोम के अलगाव को सक्षम किया। बदले में, इन शुद्ध सेल एंडोसोम द्वारा तैयार किए गए नैनोवेसिकल्स देशी ईवीएस की जैविक जटिलता को अधिक ईमानदारी से पुन: प्राप्त कर सकते हैं।

इसके अलावा, ईवी अलगाव विधि का सुनहरा मानक अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन है, जिसमें बड़े पैमाने पर सेल कल्चर मीडिया और 5 घंटे से अधिक का लंबा प्रसंस्करण समय होता है और केवल 1 × 107-1 × 108 कणों को 1 x 106 कोशिकाओं6 से उत्पन्न करता है। पारंपरिक पूरे माता पिता की कोशिका बाहर निकालना तरीकों अल्ट्रा उच्च दबाव झिल्ली बाहर निकालना और ultracentrifugation शामिल कई चरणों में शामिल, जो एक अपेक्षाकृत अधिक उपज है, लेकिन महंगा उपकरण17 की आवश्यकता है. हालांकि, ईएम उत्पादन उपज, दक्षता, लागत, और जनशक्ति काफी हद तक हमारे प्रोटोकॉल का उपयोग करके सुधार कर रहे हैं. उच्च गति homogenizer इस प्रोटोकॉल में 5 मिनट की एक छोटी प्रसंस्करण समय के लिए एक आम और कम लागत उपकरण है, और इस विधि देशी ईवीएस के साथ तुलना में 1 × 106 कोशिकाओं से 100 गुना अधिक ईएम का उत्पादन कर सकते हैं. हालांकि, इस विधि कुछ सीमाएं, इस तरह के उच्च गति homogenization के दौरान endosomal प्रोटीन के नुकसान के रूप में, और यह दिखाया गया है कि कोशिकाओं द्वारा endocytosed MNPs lysosomes, जो एक संभावित संदूषण18 हो जाएगा के लिए स्थानांतरित किया जा सकता है.

परिप्रेक्ष्य में, ईएम को अपने मूल समकक्षों के रूप में महत्वपूर्ण जैविक कार्यों को लागू करने के लिए इंजीनियर किया जा सकता है, जो जैविक चिकित्सा विज्ञान के एक उपन्यास और आशाजनक प्रकार के रूप में काम कर सकते हैं। बायोएक्टिव पदार्थ (जैसे, प्रोटीन और न्यूक्लिक एसिड) को विशिष्ट पैतृक कोशिकाओं (जैसे, स्टेम सेल19) या आनुवंशिक संशोधन (जैसे, संलयन प्रोटीन20) का चयन करके ईएम में एकीकृत किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, जीवित भ्रूण स्टेम कोशिकाओं extruding द्वारा सेल व्युत्पन्न nanovesicles वसूली या घाव भरने की प्रक्रिया19 पर एक सकारात्मक प्रभाव पड़ता है. आनुवंशिक संशोधन विशिष्ट जैविक कार्यों के साथ ईएम उत्पन्न करने के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण है। उदाहरण के लिए, जब कोशिकाओं को एंटी-एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर रिसेप्टर (ईजीएफआर) नैनोबॉडी ग्लाइकोसिलफॉस्फोस्फेटिडिलिनोसिटोल (जीपीआई) एंकर सिग्नल पेप्टाइड्स से जुड़े हुए वैक्टर के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था, तो ईजीएफआर नैनोबॉडी को ईजीएफआर-व्यक्त ट्यूमर कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए ईवीएस की सतह पर लंगर डाला जा सकता है20. ईएम ने कई प्रीक्लिनिकल अध्ययनों14 में सेल-फ्री थेरेपी और एक नैनोस्केल ड्रग डिलीवरी सिस्टम के सरोगेट के रूप में अच्छा प्रदर्शन किया है, लेकिन क्लिनिक जांच में ईवीएस और ईएम की विषमता और प्रजनन क्षमता के बारे में चिंताओं के साथ ईएम या ईवी-आधारित थेरेपी की व्यापक यंत्रवत समझ की कमी है। एक साथ लिया गया, ईएम के जैविक कार्य और उनके नैदानिक निहितार्थ आगे की जांच का वारंट करते हैं।

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Disclosures

डीडब्ल्यू और पीजी इंस्टीट्यूट ऑफ बेसिक मेडिसिन एंड कैंसर (आईबीएमसी), चाइनीज एकेडमी ऑफ साइंसेज द्वारा दायर पेटेंट आवेदन के सह-आविष्कारक हैं। अन्य लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करता है।

Acknowledgments

लेखक इंस्टीट्यूट ऑफ बेसिक मेडिसिन एंड कैंसर (आईबीएमसी), चीनी एकेडमी ऑफ साइंसेज में साझा इंस्ट्रूमेंटेशन कोर सुविधा में उपकरणों के उपयोग को स्वीकार करते हैं। इस अध्ययन को नेशनल नेचुरल साइंस फाउंडेशन ऑफ चाइना (NSFC; 82172598), झेजियांग प्रांत, चीन (LZ22H310001) के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन, झेजियांग प्रांत, चीन के स्वास्थ्य आयोग की 551 स्वास्थ्य प्रतिभा प्रशिक्षण परियोजना, हांग्जो नगर विज्ञान और प्रौद्योगिकी ब्यूरो की कृषि और सामाजिक विकास अनुसंधान परियोजना (2022ZDSJ0474) और कियानतांग अंतःविषय अनुसंधान अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Annexin antibody ABclonal A11235 Western blotting
BCA assay kit Beyotime P0012 Protein concentration assay
Calnexin GeneTex HL1598 Western blotting
CD63 antibody ABclonal A19023 Western blotting
Cell lysis buffer for Western and IP Beyotime P0013 Western blotting
Centrifuge Beckman Allegra X-30R Cell centrifuge
CO2 incubator Thermo Cell culture
Confocal laser scanning fluorescence microscopy NIKON A1 HD25 Photo the fluorescence picture
DMEM basic (1x) GIBCO C11995500BT Cell culture
Dynamic light scattering (DLS) Malvern Zetasizer Nano ZS ZEN3600 Diameter analysis
Electric glass homogenizer SCIENTZ(Ningbo, China) DY89-II Low-speed homogenization
Exosome-depleted FBS system Bioscience EXO-FBS-50A-1 Cell culture
High-speed homogenizer SCIENTZ(Ningbo, China) XHF-DY High-speed homogenization
Magnetic grate Tuohe Electromechanical Technology (Shanghai, China) NA Magnetic separation
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling Sigma-Aldrich PKH26GL-1KT The kit contains PKH26 cell linker in ethanol and Diluent C
Polylysine-modified iron oxide nanoparticles (IONPs) Zhongke Leiming Technology (Beijing, China) Mag1100-10 Cell culture
Potassium chloride Aladdin 7447-40-7 Cell hypotonic treatment
Protease inhibitor cocktail Beyotime P1030 Proteinase inhibitor
Sodium citrate Aladdin 7447-40-7 Cell hypotonic treatment
Transmission electron microscopy (TEM) JEOL JEM-2100plus Morphology image
Ultracentrifuge Beckman Optima XPN-100 Exosome centrifuge
ZetaView nanoparticle  tracking analyzers Particle Metrix PMX120 Nanoparticle tracking analysis

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References

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एंडोसोम-व्युत्पन्न पुटिकाओं के बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए एक चुंबकीय पृथक्करण-सहायता प्राप्त उच्च गति समरूपता विधि
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Wang, D., Yao, S., Guo, P. A… More

Wang, D., Yao, S., Guo, P. A Magnetic Separation-Assisted High-Speed Homogenization Method for Large-Scale Production of Endosome-Derived Vesicles. J. Vis. Exp. (203), e66021, doi:10.3791/66021 (2024).

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