Summary
Her beskriver vi en magnetisk separasjonsassistert høyhastighets homogeniseringsmetode for storskala produksjon av endosomavledede nanovesikler som en ny type eksosometterligninger (EM) som deler samme biologiske opprinnelse og lignende struktur, morfologi og proteinsammensetning av innfødte ekstracellulære vesikler (EV).
Abstract
Ekstracellulære vesikler (EV) har tiltrukket seg betydelig oppmerksomhet i fysiologisk og patologisk forskning, sykdomsdiagnose og behandling; Imidlertid har deres kliniske oversettelse blitt begrenset av mangelen på oppskaleringsproduksjonsmetoder. Derfor gir denne protokollen en magnetisk separasjonsassistert høyhastighets homogeniseringsmetode for storskala produksjon av endosomavledede nanovesikler som en ny type eksosometterligninger (EM) avledet fra endosomene, som har omtrent 100 ganger høyere utbytte enn konvensjonell ultrasentrifugeringsmetode. I denne metoden ble magnetiske nanopartikler (MNP) internalisert av foreldreceller via endocytose og ble deretter akkumulert i deres endosomer. Deretter ble MNP-belastede endosomer samlet og renset ved hypotonisk behandling og magnetisk separasjon. En høyhastighets homogenisator ble benyttet til å bryte MNP-belastede endosomer i monodisperse nanovesikler. De resulterende endosomavledede vesiklene har samme biologiske opprinnelse og struktur, karakterisert ved nanopartikkelsporingsanalyse, transmisjonselektronmikroskop og vestlig blotting. Deres morfologi og proteinsammensetning ligner på innfødte EV-er, noe som indikerer at EM-er potensielt kan tjene som et billig surrogat med høy avkastning av innfødte elbiler for kliniske oversettelser.
Introduction
Ekstracellulære vesikler (EV) er små vesikler som utskilles av nesten alle celler med et størrelsesområde på 30-150 nm, som inneholder rikelig med bioaktive stoffer. Avhengig av opprinnelsescellen viser EV høy heterogenitet, og har flere komponenter som er spesifikke for foreldreceller1. EV-er slippes ut i kroppsvæsker og transporteres til fjerne steder hvor de tas opp av målceller for handling2, som kan brukes til å levere et bredt spekter av bioaktive molekyler og medisiner for vevsreparasjon, tumordiagnose og behandling og immunmodulering 3,4. Imidlertid påvirker andre biologiske nanopartikler (f.eks. Lipoproteiner) og nanovesikler (f.eks. EV avledet fra ikke-endosomale veier) med lignende biofysiske egenskaper i kroppsvæsker uunngåelig EV-isolasjon og rensing. Til dags dato er ultrasentrifugering fortsatt gullstandarden for EV-isolasjon, og andre isolasjonsmetoder, inkludert sentrifugering av sukrosetetthetsgradient, ultrafiltrering, polyetylenglykolutfelling, kromatografi og immunmagnetisk perleisolasjon, har blitt utviklet5. Den nåværende flaskehalsen som begrenser klinisk oversettelse og kommersialisering av EV-terapi er den alvorlige mangelen på isolasjonsteknikker som muliggjør svært skalerbar og reproduserbar isolasjon av EV 6,7,8. Tradisjonelle EV-isolasjonsteknikker (f.eks. ultrasentrifugering og størrelsesekskluderingskromatografi) lider av lavt utbytte (1 x 107-1 x 108/1 x 10 6 celler), lang produksjonssyklus (24-48 timer), dårlig reproduserbarhet av produktkvalitet, og krever dyrt og energiintensivt produksjonsutstyr som ikke kan møte dagens kliniske etterspørsel etter EV6.
Exosome mimics (EMs), syntetiske surrogater av innfødte EVer, har tiltrukket seg viktig oppmerksomhet på grunn av deres svært like struktur, funksjon og skalerbarhet i produksjonen. Hovedkilden til EM er fra direkte ekstrudering av hele foreldreceller med kontinuerlig seksjonering9,10, som demonstrerer potente biologiske funksjoner som innfødte EV11,12. For eksempel utøver EM avledet fra humane navlestrengsmesenkymale stamceller (hUCMSC) lignende sårhelende effekter som innfødte EV og er rikere på proteinsammensetning13. Selv om EM avledet fra hele celler har den biologiske kompleksiteten til EV, er deres største ulempe heterogeniteten til produkter fordi de uunngåelig er forurenset av forskjellige cellulære organeller og celleavfall. Proteinlokaliseringsanalyse viste videre at EM avledet fra helcelleekstrudering inneholder mange ikke-EV-spesifikke proteiner fra mitokondrier og endoplasmatisk retikulum13. Videre krever de fleste metoder for produksjon av EM fortsatt ultrasentrifugering, en svært tid- og energikrevende prosess14. Tatt i betraktning det faktum at eksosomer utelukkende er avledet fra cellulære endosomer, antydet vi at bioengineerte endosomavledede nanovesikler bedre kan rekapitulere den biologiske homologien mellom eksosomer og EM i sammenligning med de veletablerte cellemembranavledede EMene produsert ved helcelleekstruderingsmetode14. Likevel er fremstillingen av endosomavledede nanovesikler vanskelig på grunn av mangel på levedyktige tilnærminger.
Kliniske studier har blitt utført ved å bruke EV som surrogat for cellefri terapi og et nanoskala legemiddelleveringssystem for behandling av ulike sykdommer. For eksempel har EV avledet fra benmarg mesenkymale stamceller blitt brukt til å behandle alvorlig lungebetennelse forårsaket av COVID-19 og har oppnådd lovende resultater. Nylig har genetisk konstruerte elbiler som bærer CD24-proteiner også vist potente terapeutiske fordeler for behandling av COVID-19-pasienter15,16. Imidlertid kan det kliniske kravet til EV-terapi fortsatt ikke oppfylles med tradisjonelle isolasjonsmetoder på grunn av lavt utbytte og kostnad. Denne studien rapporterer storskala produksjon av endosomavledede nanovesikler via en magnetisk separasjonsassistert høyhastighets homogeniseringsmetode. Det utnytter endocytoseveien til MNPs for å isolere MNP-belastede endosomer via magnetisk separasjon, etterfulgt av høyhastighets homogenisering for å formulere endosomer i monodisperse nanovesikler. Siden typer endosomer samlet inn av denne protokollen er forskjellige, er det fortsatt nødvendig med ytterligere grundig forskning for å etablere god produksjonspraksis (GMP) i bransjen. Denne nye EM-forberedelsesmetoden er mer tidseffektiv (5 min høyhastighets homogenisering) for å oppnå nanovesikler som er homologe med innfødte EVer. Det produserer eksponentielt flere vesikler fra samme mengder celler enn ultracentrifugation, som generelt kan brukes på forskjellige celletyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Et skjema over metoden er vist i figur 1.
1. EM-forberedelse og isolasjon
- Celleinternalisering av MNPs
- Cellekultur
- Suspender 1 × 106 mesenkymale stamceller fra rottebenmarg (BMSC), 293T-celler eller ovarieepitelkreftceller fra mus (ID8) i DMEM komplett medium med 10% føtal bovint serum (FBS) og 5% penicillin-streptomycinløsning (P / S) i 2 ml per seksbrønnsplate (se materialtabell).
- Dyrk cellene over natten ved 37 °C og 5% CO2.
MERK: Antall celler etter adherens var ca. 1 × 106.
- Endocytose av MNP
- Reduser middels volumet på hver seksbrønnsplate til 1 ml. Samkultur av cellene med 10 nm polylysinmodifiserte jernoksid nanopartikler (IONP) (se materialtabell) i en konsentrasjon på 100 μg / 1 × 106 celler og inkuberer ved 37 ° C i en atmosfære som inneholder 5% CO2 i 12 timer for å tillate cellene å endocytose IONP fullt ut.
- Cellekultur
- Isolering og homogenisering av endosomer
- Cell hypotonisk behandling
- Fordøy cellene som har fullstendig internalisert IONP med 0,5 ml / brønntrypsin i 3 minutter, og avslutt fordøyelsen ved å legge til 1 ml / godt komplett medium.
- Sentrifuger ved 1000 x g i 5 minutter, og kast supernatanten. Resuspender cellene i fosfatbuffersaltvann (PBS) og sentrifuge, gjentatte ganger to ganger for å vaske ut restmediet og uabsorberte IONP.
- Til slutt skal pelleten resuspenderes i 8 ml i ferdig tilberedt hypoton oppløsning (71,4 mM kaliumklorid, 1,3 mM natriumsitrat, pH 7,2-7,4) i 15 minutter (se materialfortegnelse).
- Frigjøring av organeller ved lavhastighets homogenisering
- Overfør cellesuspensjonen i hypotonisk oppløsning til et glassreagensrør og slipp organellene ved hjelp av en glasshomogenisator (se materialtabell) med 20 støt ved 1000 o / min.
- Magnetisk separasjon for å oppnå endosomer
- Overfør 1 ml av den homogeniserte celleoppløsningen til et 1,5 ml mikrosentrifugerør og sett i en magnetisk separator i 1 time for å fullstendig skille IONP-belastede endosomer fra andre organeller (som kjerne og mitokondrier) og celleavfall.
- Samle de brune pellets på kontaktflaten til mikrosentrifugerørene ved siden av magnetrammen (se materialtabell), dvs. de IONP-belastede endosomene. Kast væsken i mikrosentrifugerørene og tilsett 3 ml PBS for å resuspendere endosomene.
- Cell hypotonisk behandling
- Høyhastighets homogenisering
- Overfør løsningen som inneholder endosomene til et 15 ml sentrifugerør med et væskevolum mellom 3-10 ml.
- Forleng 10 mm sonden til høyhastighetshomogenisatoren (se materialfortegnelse) til bunnen av sentrifugerøret uten å berøre bunnen. Juster hastighetsknappen under skjermen, sett hastigheten til 140 x g, og juster Tid-knappen for å stille inn tiden på 5 min, og trykk deretter på OK-knappen.
- Trykk på Start-knappen for å utføre homogeniseringen etter å ha plassert en isboks under prøven.
- Magnetisk sortering for EM-er
- Overfør løsningen som inneholder nanovesikler oppnådd fra høyhastighets homogenisering til 1,5 ml mikrosentrifugerøret og sett den i en magnetisk separator i 1 time.
- Samle væsken som inneholder de nødvendige EM-ene. Vær forsiktig så du ikke berører overflaten av rørene ved siden av magnetrammen, som adsorberte frie IONP og IONP-belastede EMer.
2. EM-karakterisering (figur 2 og figur 3)
- Analyse av dynamisk lysspredning (DLS)
- Injiser 1 ml EM-prøve (20 μg/ml) langs veggen inn i kyvetten og plasser den i instrumentprøvesporet på DLS-instrumentet (se materialfortegnelse).
- Åpne DLS-programvaren, velg Particle Size Test, og start testingen.
- Mål proteinkonsentrasjonen ved hjelp av et BCA-proteinanalysesett (se materialtabell).
- Analyse av sporing av nanopartikler (NTA)
- Fortynn EMs med PBS til en oppløsning ved 1 × 107-1 × 108 partikler / ml og injiser dem inn i kammeret til NTA-instrumentet (se materialtabellen) ved hjelp av en 1 ml sprøyte med en strømningshastighet på 500-1000 μL / min.
- Åpne de 488 laserkanalene og sørg for at antall EM-er i programvaregrensesnittet er innenfor 100-300 og i brownsk bevegelse.
- I henhold til produsentens protokoll velger du riktig SOP (EV-488) for å sikre at instrumentets følsomhet er egnet for EM-deteksjon.
- Transmisjonselektronmikroskopi (TEM)
- Fest EMs (1 mg / ml) med et likt volum på 5% glutaraldehyd i 30 minutter, og kvantifiser konsentrasjonen av EMs som 1 mg / ml ved BCA-proteinanalysesett.
- Plasser en 10 μL dråpe EM på karbonsiden av kobbernettet, og fjern overflødig væske fra siden med filterpapir etter 10 minutter. Tilsett 10 μL PBS og blott umiddelbart med filterpapir. Gjenta to ganger for å fjerne overflødig glutaraldehyd.
- Slipp 5 μL uranylacetatkontrastmiddel og flekk negativt i 1 min, og fjern deretter overflødig kontrastmiddel. Vask tre ganger med avionisert vann og tørk ved romtemperatur (RT).
- Ta bilde med en TEM ved en akselerasjonsspenning på 100 kV.
- Vestlig blotting
- Tilsett 100 μL cellelysebuffer og 5 μL av en 50x proteasehemmercocktail til prøvene (se materialfortegnelse). Bland forsiktig med en pipettepistol og legg på is i 30 minutter.
- Sentrifuger løsningen ved 1000 x g i 10 minutter ved 4 °C, kvantifiser proteinkonsentrasjonen av supernatanten med et BCA-proteinanalysesett, og samle den.
- Bland 100 μL supernatanten med 25 μL 5x proteinbelastningsbuffer og varm opp ved 95 °C i 10 minutter.
- Forbered geler i henhold til instruksjonene i de forhåndsformede gelene. Last 15 μg protein per brønn og kjørt av gelelektroforese ved 80 V. Vent til prøven løper til separasjonsgelen, bytt til 100 V, og overfør deretter proteinet til en nitrocellulosemembran ved 100 V, 60 minutter under isbad.
- Pådag de ikke-EV-spesifikke markørene (Calnexin) og EV-biomarkørene (Annexin og CD63) ved vestlig blotting (se Materialfortegnelse).
MERK: Antistoffene er fortynnet i henhold til produsentens anbefalinger.
3. Påvisning av in vitro EM-funksjon
- EM-merking
- Bland 1 μL PKH26 med 250 μL fortynningsmiddel C (1:250) for å lage 2x fargeløsning (4 × 10-6 M) (se materialfortegnelse).
- Bland 250 mikrol EM (1 mg/ml) med 250 μL 2x fargeoppløsning og blås raskt med en pipettepistol.
- Inkuber ved RT i 2-5 min mens du forsiktig inverterer sentrifugerøret.
- Tilsett et like stort volum serum eller 1% bovint serumprotein og inkuber i 1 min for å avslutte fordøyelsen.
- Fjern overflødig PKH26 ved ultrafiltrering med 1000 KD ultrafiltreringsrør ved 3000 x g i 30 minutter, og gjenta tre ganger ved å tilsette PBS. Suspender den gjenværende væsken til 500 μL med PBS og filtrer gjennom et 0,22 μm filter.
- Analyse av opptak av celler
- Celleinokulasjon: Frø 1 × 106 celler i 35 mm konfokale retter med 1 ml DMEM inneholdende 10% FBS og 5% P/S, og ruges ved 37 °C og 5% CO2 over natten.
- Filtrer EM-ene med 0,22 μm sterile sprøytefiltre for å fjerne potensiell forurensning.
- Behandle cellene med PKH26-merkede EMs (109 partikler / ml) i 8 timer.
- Vask tre ganger med PBS, tilsett DAPI (10 ng/ml), og rug i 10 minutter ved RT.
- Skaff fluorescensbildene i konfokal laserskanning fluorescensmikroskopi ved hjelp av 405 nm og 561 nm laserkanaler (se materialfortegnelse).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Arbeidsflyten for EM-forberedelse ved magnetisk separasjonsassistert høyhastighets homogenisering er vist i figur 1. Celler internaliserer 10 nm polylysinmodifiserte IONP, som spesifikt akkumuleres i endosomer via endocytose (figur 3A). Etter å ha blitt behandlet med hypotonisk buffer og homogenisert, frigjøres de IONP-lastede endosomene fra cellene og samles deretter ved magnetisk separasjon. De isolerte endosomene rekonstitueres videre til monodisperse nanovesikler, også kjent som EM, ved høyhastighets homogenisering. Vi utforsket flere nøkkelparametere (f.eks. homogeniseringshastighet og tid) for å identifisere optimaliserte EM-forberedelsesforhold (figur 2). Til slutt ble en homogeniseringshastighet på 140 x g i 5 minutter valgt som optimalisert tilstand ved å vurdere partikkelstørrelsen og utbyttet av produserte EM. Frie IONP-er og IONP-lastede EM-er fjernes til slutt fra sluttproduktløsningen ved en andre runde magnetisk separasjon for å oppnå IONP-frie EM-er. Metoden produserer svært ensartede og monodispergerte nanovesikler fra foreldrecelleendosomer, som deler samme biologiske opprinnelse som innfødte EVer.
For å sammenligne elbiler oppnådd ved ultrasentrifugering med EM generert av denne metoden, ble BMSC og 293T forberedt for EV og EM. Diameteren og morfologien til EM ble analysert av NTA og TEM. Morfologien til BMSC-EM har funksjonen til en typisk bolleformet vesikkellignende struktur og er avgrenset av et lipid-dobbeltlag (figur 3A). Som analysert av NTA har både BMSC-EM og 293T-EM en lignende hydrodynamisk diameter som innfødte EV (BMSC-EV og 293T-EV) (figur 3B). BMSC-EMs utbytter av høyhastighets homogenisering var 8,16 × 10 8-1,42 × 109/1 × 10 6 celler, og utbyttet av innfødte EVer fremstilt ved ultracentrifugering var bare 7,2 × 10 7-1,12 × 108/1 × 106celler. Tilsvarende var 293T-EMs utbytte av høyhastighets homogenisering 3,71 × 10 8-7,58 × 108/1 × 10 6 celler, som når opp til omtrent 100 ganger høyere enn de av innfødte 293T-EVer fremstilt ved den konvensjonelle ultrasentrifugemetoden (≈5,5 × 10 6/1 × 106 celler) (figur 4A).
Videre viste vestlige blottingsresultater at BMSC-EM inneholder de samme proteinbiomarkørene som EV (CD63 og Annexin). Både EM og EV er negative for Calnexin-uttrykk, noe som tyder på at EM produsert ved denne metoden nesten ikke hadde plasmamembranforurensning (figur 3C). Det er ingen signifikant forskjell i proteinkonsentrasjon mellom EM og EV, BMSC-EMs og BMSC-EVs viste lignende totale proteinkonsentrasjoner, 11,15 μg / 1 × 10 9 partikler og 14,71 μg / 1 × 109 partikler via BCA-proteinanalysesettet. Videre viste 293T-EMs og 293T-EVs totale proteinkonsentrasjoner på henholdsvis ca. 31,8 μg / 1 × 10 9 partikler og 9,95 μg / 1 × 109 partikler (figur 4B). Disse resultatene indikerer at EM har en lignende proteinsammensetning som innfødte elbiler. For å oppdage om EM kan endocytoiseres, ble PKH26-merkede EMs og EVs co-inkubert med BMSC og ID8 i en konsentrasjon på 1 × 109 partikler / ml i 8 timer, og cellene ble observert under konfokal fluorescensmikroskopi for å bekrefte at EM lett kunne tas opp av cellene for handling så vel som EV (figur 5).
Figur 1: Skjematisk diagram over magnetisk assistert høyhastighets homogeniseringsmetode. Trinn 1: Celler internaliserer IONP til endosomer gjennom endocytose. Trinn 2: Samle organeller, inkludert IONP-lastede endosomer, etter hypotonisk behandling og homogenisering. Trinn 3: Rens IONP-belastede endosomer ved magnetisk separasjon. Trinn 4: Endosomene homogeniseres og rekonstitueres til monodisperse nanovesikler. Trinn 5: Fjern gratis IONP og IONP-belastede EM-er ved magnetisk separasjon for å samle IONP-frie EM-er. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Optimalisering av EM-forberedelsesforhold . (A) Diameteren og PDI til BMSC-EMs som respons på homogeniseringshastighetsendringer når tiden er satt til 5 minutter ble analysert av DLS. (B) Diameteren og PDI av BMSC-EMs som respons på homogeniseringstidsendringer når homogeniseringshastigheten er satt til 140 x g ble analysert av DLS. (C) Diameteren og PDI til BMSC-EM ved forskjellige lagringstidspunkter ble analysert av DLS. (D) Diameteren og konsentrasjonen av BMSC-EMs som respons på homogeniseringshastighetsendringer når tiden er satt til 5 minutter ble analysert av NTA. (E) Diameteren og konsentrasjonen av BMSC-EMs som respons på homogeniseringstidsendringen når homogeniseringshastigheten er satt til 140 x g ble analysert av NTA. (F) Diameteren og utbyttet av BMSC-EMs som respons på BMSC-celler co-inkubasjon med IONP av forskjellige konsentrasjoner ble analysert av NTA. p < 0,0001. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Karakterisering av EM. (A) TEM-karakterisering av morfologien til foreldreceller med endocytoserte IONP, endosomer og EM. Skalastengene representerer 500 nm. (B) Hydrodynamiske diametre av BMSC-EM, BMSC-EV, 293T-EM og 293T-EV er karakterisert ved NTA. (C) Western blot analyseresultater av BMSC-EMs, BMSC-EVs og BMSC-cellelysater. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Utbyttet av EM er høyere enn EV. (A) Utbyttet av EM og EV fremstilt fra BMSC og 293T ble analysert av NTA. (B) Proteinutbytte av EM og EV fremstilt fra BMSC og 293T. **p < 0,01. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Representative fluorescerende mikroskopbilder av PKH26-merkede EV og EM internalisert av BMSC og ID8. Skalastengene representerer 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Som et surrogat for cellefri terapi og et nanoskala legemiddelleveringssystem har elbiler ennå ikke oppfylt sine kliniske forventninger, og en hovedhindring er mangelen på skalerbare og reproduserbare produksjons- og rensemetoder6. Derfor har ulike typer EM blitt utviklet som EV-analoger med tilsvarende biologisk kompleksitet14. Til dags dato er det mest brukte EM-eksemplet celleplasmamembranavledede nanovesikler. Fremstillingen av slike nanovesikler er relativt enkel og grei ved direkte ekstrudering av hele foreldreceller17. Imidlertid kan celleplasmamembranavledede nanovesikler ikke rekapitulere innfødte EV på grunn av to ulemper: For det første er den biologiske opprinnelsen til disse nanovesiklene fra celleplasmamembran, som inneholder forskjellige lipid- og proteinsammensetninger i sammenligning med innfødte EVer; For det andre, forurensningene, inkludert proteiner, nukleinsyrer og lipider fra ikke-EV-organeller og celleavfall, forårsaker uunngåelig EM-heterogenitet. I denne metoden inkuberte vi celler med IONP og samlet IONP-lastede endosomer gjennom magnetisk separasjon, og genererte deretter monodisperse nanovesikler via høyhastighets homogenisering, og til slutt oppnådde IONP-frie EM ved en andre runde magnetisk separasjon. Videre optimaliserte vi EM-forberedelsesforholdene ved å utforske virkningen av forskjellige parametere, for eksempel homogeniseringshastighet og tid, på EM-størrelse og utbytte. Denne protokollen utnytter et interessant biologisk fenomen: MNP (f.eks. 10 nm IONP) kan effektivt internaliseres av nesten alle celler via endocytose og utelukkende akkumuleres i endosomer, ikke andre organeller. Denne unike biologiske prosessen muliggjorde isolering av MNP-belastede endosomer uten ikke-EV-forurensninger via magnetisk separasjon. Til gjengjeld kan nanovesikler fremstilt av disse rensede celleendosomene mer trofast rekapitulere den biologiske kompleksiteten til innfødte EVer.
Videre er den gyldne standarden for EV-isolasjonsmetoden ultrasentrifugering, som koster massive cellekulturmedier og en lang behandlingstid på over 5 timer og produserer bare 1 × 107-1 × 108 partikler fra 1 x 10 6 celler6. Tradisjonelle ekstruderingsmetoder for hele foreldreceller inkluderer flere trinn som involverer membranekstrudering med ultrahøyt trykk og ultrasentrifugering, som har relativt høyere utbytte, men krever dyrt utstyr17. Imidlertid forbedres EM-produksjonsutbyttet, effektiviteten, kostnadene og arbeidskraften betydelig ved å bruke protokollen vår. Høyhastighets homogenisatoren er et vanlig og billig utstyr for en kort behandlingstid på 5 minutter i denne protokollen, og denne metoden kan produsere opptil 100 ganger flere EM-er fra 1 × 106-celler sammenlignet med innfødte EV-er. Imidlertid har denne metoden noen begrensninger, for eksempel tap av endosomale proteiner under høyhastighets homogenisering, og det har vist seg at MNPs endocytosert av celler kan overføres til lysosomer, noe som ville være en potensiell forurensning18.
I perspektiv kan EM konstrueres for å utøve viktige biologiske funksjoner som deres opprinnelige kolleger, noe som kan tjene som en ny og lovende type biologisk terapi. Bioaktive stoffer (f.eks. proteiner og nukleinsyrer) kan integreres i EM ved å velge spesifikke foreldreceller (f.eks. Stamceller19) eller genetisk modifisering (f.eks. fusjonsproteiner20). For eksempel har celleavledede nanovesikler ved ekstrudering av levende embryonale stamceller en positiv effekt på gjenopprettings- eller sårhelingsprosessen19. Genetisk modifikasjon er en alternativ tilnærming for å generere EM med spesifikke biologiske funksjoner. For eksempel, når celler ble transfektert med vektorer av anti-epidermal vekstfaktorreseptor (EGFR) nanolegemer fusjonert til glykosylfosfatidylinositol (GPI) ankersignalpeptider, kan EGFR-nanokroppene forankres på overflaten av EV for å målrette EGFR-uttrykkende tumorceller20. EM har fungert bra som et surrogat for cellefri terapi og et nanoskala legemiddelleveringssystem i flere prekliniske studier14, men det mangler en omfattende mekanistisk forståelse av EM eller EV-basert terapi med bekymringer om heterogeniteten og reproduserbarheten til EV og EM i kliniske undersøkelser. Samlet sett tilsier de biologiske funksjonene til EM og deres kliniske implikasjoner ytterligere undersøkelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
DW og PG er medoppfinnere av en patentsøknad innlevert av Institute of Basic Medicine and Cancer (IBMC), Chinese Academy of Sciences. Den andre forfatteren oppgir ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Forfatterne anerkjenner bruken av instrumenter ved Shared Instrumentation Core Facility ved Institute of Basic Medicine and Cancer (IBMC), Chinese Academy of Sciences. Denne studien ble støttet av National Natural Science Foundation of China (NSFC; 82172598), Natural Science Foundation of Zhejiang-provinsen, Kina (LZ22H310001), 551 Health Talent Training Project of Health Commission of Zhejiang-provinsen, Kina, Agricultural and Social Development Research Project of Hangzhou Municipal Science and Technology Bureau (2022ZDSJ0474) og Qiantang Interdisciplinary Research Grant.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Annexin antibody | ABclonal | A11235 | Western blotting |
| BCA assay kit | Beyotime | P0012 | Protein concentration assay |
| Calnexin | GeneTex | HL1598 | Western blotting |
| CD63 antibody | ABclonal | A19023 | Western blotting |
| Cell lysis buffer for Western and IP | Beyotime | P0013 | Western blotting |
| Centrifuge | Beckman | Allegra X-30R | Cell centrifuge |
| CO2 incubator | Thermo | Cell culture | |
| Confocal laser scanning fluorescence microscopy | NIKON | A1 HD25 | Photo the fluorescence picture |
| DMEM basic (1x) | GIBCO | C11995500BT | Cell culture |
| Dynamic light scattering (DLS) | Malvern | Zetasizer Nano ZS ZEN3600 | Diameter analysis |
| Electric glass homogenizer | SCIENTZ(Ningbo, China) | DY89-II | Low-speed homogenization |
| Exosome-depleted FBS | system Bioscience | EXO-FBS-50A-1 | Cell culture |
| High-speed homogenizer | SCIENTZ(Ningbo, China) | XHF-DY | High-speed homogenization |
| Magnetic grate | Tuohe Electromechanical Technology (Shanghai, China) | NA | Magnetic separation |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich | PKH26GL-1KT | The kit contains PKH26 cell linker in ethanol and Diluent C |
| Polylysine-modified iron oxide nanoparticles (IONPs) | Zhongke Leiming Technology (Beijing, China) | Mag1100-10 | Cell culture |
| Potassium chloride | Aladdin | 7447-40-7 | Cell hypotonic treatment |
| Protease inhibitor cocktail | Beyotime | P1030 | Proteinase inhibitor |
| Sodium citrate | Aladdin | 7447-40-7 | Cell hypotonic treatment |
| Transmission electron microscopy (TEM) | JEOL | JEM-2100plus | Morphology image |
| Ultracentrifuge | Beckman | Optima XPN-100 | Exosome centrifuge |
| ZetaView nanoparticle tracking analyzers | Particle Metrix | PMX120 | Nanoparticle tracking analysis |
References
- Kalluri, R., LeBleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (6478), eaau6977 (2020).
- Hyenne, V., et al. RAL-1 controls multivesicular body biogenesis and exosome secretion. J Cell Biol. 211 (1), 27-37 (2015).
- Farooqi, A. A., et al. Exosome biogenesis, bioactivities and functions as new delivery systems of natural compounds. Biotechnol Adv. 36 (1), 328-334 (2018).
- Gatti, S., et al. Microvesicles derived from human adult mesenchymal stem cells protect against ischaemia-reperfusion-induced acute and chronic kidney injury. Nephrol Dial Transplant. 26 (5), 1474-1483 (2011).
- Zhang, Y., et al. Exosome: A review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications. Int J Nanomedicine. 15, 6917-6934 (2020).
- Yang, D., et al. Progress, opportunity, and perspective on exosome isolation - efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
- Castilletti, C., et al. Coordinate induction of IFN-alpha and -gamma by SARS-CoV also in the absence of virus replication. Virology. 341 (1), 163-169 (2005).
- Guo, P., Huang, J., Moses, M. A. Cancer nanomedicines in an evolving oncology landscape. Trends Pharmacol Sci. 41 (10), 730-742 (2020).
- Jo, W., et al.
- Yoon, J., et al. Generation of nanovesicles with sliced cellular membrane fragments for exogenous material delivery. Biomaterials. 59, 12-20 (2015).
- Li, M., et al. Exosome mimetics derived from bone marrow mesenchymal stem cells ablate neuroblastoma tumor in vitro and in vivo. Biomater Adv. 142, 213161 (2022).
- Wang, J., et al. Exosome mimetics derived from bone marrow mesenchymal stem cells deliver doxorubicin to osteosarcoma in vitro and in vivo. Drug Deliv. 29 (1), 3291-3303 (2022).
- Zhang, Z., et al. Comprehensive proteomic analysis of exosome mimetic vesicles and exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 312 (2022).
- Li, Y. J., et al. Artificial exosomes for translational nanomedicine. J Nanobiotechnology. 19 (1), 242 (2021).
- Yang, W., et al. Clinical characteristics of 310 SARS-CoV-2 Omicron variant patients and comparison with Delta and Beta variant patients in China. Virol Sin. 37 (5), 12 (2022).
- Shapira, S., et al. A novel platform for attenuating immune hyperactivity using EXO-CD24 in COVID-19 and beyond. EMBO Mol Med. 14 (9), 15997 (2022).
- Jang, S. C., et al. Bioinspired exosome-mimetic nanovesicles for targeted delivery of chemotherapeutics to malignant tumors. ACS Nano. 7 (9), 7698-7710 (2013).
- Le, T. S., et al. Quick and mild isolation of intact lysosomes using magnetic-plasmonic hybrid nanoparticles. ACS Nano. 16 (1), 885-896 (2022).
- Jeong, D., et al. Nanovesicles engineered from ES cells for enhanced cell proliferation. Biomaterials. 35 (34), 9302-9310 (2014).
- Kooijmans, S. A., et al. Display of GPI-anchored anti-EGFR nanobodies on extracellular vesicles promotes tumour cell targeting. J Extracell Vesicles. 5, 31053 (2016).
