Summary
هنا ، نصف طريقة التجانس عالية السرعة بمساعدة الفصل المغناطيسي للإنتاج على نطاق واسع للحويصلات النانوية المشتقة من الإندوسوم كنوع جديد من محاكاة الإكسوسوم (EMs) التي تشترك في نفس الأصل البيولوجي والبنية المماثلة والتشكل وتكوين البروتين للحويصلات الأصلية خارج الخلية (EVs).
Abstract
جذبت الحويصلات خارج الخلية (EVs) اهتماما كبيرا في البحوث الفسيولوجية والمرضية وتشخيص الأمراض وعلاجها. ومع ذلك ، كانت ترجمتهم السريرية محدودة بسبب عدم وجود مناهج تصنيع واسعة النطاق. لذلك ، يوفر هذا البروتوكول طريقة تجانس عالية السرعة بمساعدة الفصل المغناطيسي للإنتاج على نطاق واسع للحويصلات النانوية المشتقة من الإندوسوم كنوع جديد من محاكاة الإكسوسوم (EMs) المشتقة من الإندوسومات ، والتي لها عائد أعلى بحوالي 100 مرة من طريقة الطرد المركزي الفائق التقليدية. في هذه الطريقة ، تم استيعاب الجسيمات النانوية المغناطيسية (MNPs) بواسطة الخلايا الأبوية عن طريق التداخل الخلوي وتراكمت لاحقا داخل إندوسوماتها. بعد ذلك ، تم جمع الإندوسومات المحملة ب MNPs وتنقيتها عن طريق المعالجة منخفضة التوتر والفصل المغناطيسي. تم استخدام خالط عالي السرعة لكسر الإندوسومات المحملة ب MNP إلى حويصلات نانوية أحادية التشتت. تتميز الحويصلات المشتقة من الإندوسوم الناتجة بنفس الأصل البيولوجي والبنية ، والتي تتميز بتحليل تتبع الجسيمات النانوية ، والمجهر الإلكتروني النافذ ، والنشاف الغربي. يتشابه مورفولوجيتها وتكوين البروتين مع المركبات الكهربائية الأصلية ، مما يشير إلى أن EMs قد تكون بمثابة بديل منخفض التكلفة وعالي العائد للمركبات الكهربائية الأصلية للترجمات السريرية.
Introduction
الحويصلات خارج الخلية (EVs) هي حويصلات صغيرة تفرزها جميع الخلايا تقريبا بحجم يتراوح بين 30 و 150 نانومتر ، وتحتوي على مواد نشطة بيولوجيا وفيرة. اعتمادا على خلية المنشأ ، تظهر EVs عدم تجانس عالي ، وتمتلك مكونات متعددة خاصة بالخلايا الأم1. يتم إطلاق EVs في سوائل الجسم ونقلها إلى مواقع بعيدة حيث يتم تناولها بواسطة الخلايا المستهدفة للعمل2 ، والتي يمكن استخدامها لتقديم مجموعة واسعة من الجزيئات والأدوية النشطة بيولوجيا لإصلاح الأنسجة وتشخيص الورم وعلاجه والتعديل المناعي 3,4. ومع ذلك ، فإن الجسيمات النانوية البيولوجية الأخرى (مثل البروتينات الدهنية) والحويصلات النانوية (على سبيل المثال ، EVs المشتقة من مسارات غير إندوزومية) ذات خصائص فيزيائية حيوية مماثلة في سوائل الجسم تؤثر حتما على عزل EV وتنقيته. حتى الآن ، لا يزال الطرد المركزي الفائق هو المعيار الذهبي لعزل EV ، وقد تم تطوير طرق عزل أخرى ، بما في ذلك الطرد المركزي المتدرج لكثافة السكروز ، والترشيح الفائق ، وترسيب البولي إيثيلين جلايكول ، والكروماتوغرافيا ، وعزل حبة المغناطيسية المناعية، 5. يتمثل عنق الزجاجة الحالي الذي يحد من الترجمة السريرية وتسويق علاجات المركبات الكهربائية في النقص الحاد في تقنيات العزل التي تسمح بعزل قابل للتطوير والتكرار بدرجة كبيرة للمركبات الكهربائية6،7،8. تعاني تقنيات عزل المركبات الكهربائية التقليدية (على سبيل المثال ، الطرد المركزي الفائق وكروماتوغرافيا استبعاد الحجم) من انخفاض العائد (1 × 107-1 × 108/1 × 10 6 خلايا) ، ودورة إنتاج طويلة (24-48 ساعة) ، وضعف قابلية استنساخ جودة المنتج ، وتتطلب معدات إنتاج باهظة الثمن وكثيفة الاستهلاك للطاقة لا يمكنها تلبية الطلب السريري الحالي على المركبات الكهربائية6.
جذبت محاكاة Exosome (EMs) ، وهي بدائل اصطناعية للمركبات الكهربائية الأصلية ، اهتماما كبيرا نظرا لهيكلها ووظيفتها وقابليتها للتوسع في الإنتاج. المصدر الرئيسي لل EMs هو من البثق المباشر للخلايا الأبوية الكاملة مع التقسيم المستمر9,10 ، مما يدل على وظائف بيولوجية قوية مثل EVsالأصلية 11,12. على سبيل المثال ، تمارس EMs المشتقة من الخلايا الجذعية الوسيطة للحبل السري البشري (hUCMSCs) تأثيرات مماثلة لالتئام الجروح مثل EVs الأصلية وهي أكثر ثراء في تكوين البروتين13. على الرغم من أن EMs المشتقة من خلايا كاملة لها التعقيد البيولوجي للمركبات الكهربائية ، إلا أن عيبها الرئيسي هو عدم تجانس المنتجات لأنها ملوثة حتما بالعضيات الخلوية المختلفة وحطام الخلايا. كشف تحليل توطين البروتين كذلك أن EMs المشتقة من بثق الخلية الكاملة تحتوي على العديد من البروتينات غير الخاصة ب EVs من الميتوكوندريا والشبكة الإندوبلازمية13. علاوة على ذلك ، لا تزال معظم طرق تصنيع EMs تتطلب الطرد المركزي الفائق ، وهي عملية تستغرق وقتا طويلا وتستهلك الطاقة14. بالنظر إلى حقيقة أن الإكسوسومات مشتقة حصريا من الإندوسومات الخلوية ، افترضنا أن الحويصلات النانوية المشتقة من الإندوسوم المهندسة بيولوجيا قد تلخص بشكل أفضل التماثل البيولوجي بين الإكسوسومات و EMs مقارنة ب EMs المشتقة من غشاء الخلية الراسخة التي تنتجها طريقة بثق الخليةالكاملة 14. ومع ذلك ، فإن تصنيع الحويصلات النانوية المشتقة من الإندوسوم أمر صعب بسبب عدم وجود نهج قابلة للتطبيق.
تم إجراء الدراسات السريرية من خلال استخدام EVs كبديل للعلاج الخالي من الخلايا ونظام توصيل الأدوية النانوية لعلاج الأمراض المختلفة. على سبيل المثال ، تم استخدام EVs المشتقة من الخلايا الجذعية الوسيطة لنخاع العظم لعلاج الالتهاب الرئوي الحاد الناجم عن COVID-19 وحققت نتائج واعدة. في الآونة الأخيرة ، أظهرت المركبات الكهربائية المعدلة وراثيا التي تحمل بروتينات CD24 أيضا فوائد علاجية قوية لعلاج مرضى COVID-1915,16. ومع ذلك ، لا يزال من غير الممكن تلبية المتطلبات السريرية للعلاج ب EV بطرق العزل التقليدية بسبب انخفاض العائد والتكلفة. تشير هذه الدراسة إلى الإنتاج الواسع النطاق للحويصلات النانوية المشتقة من الإندوسوم عبر نهج التجانس عالي السرعة بمساعدة الفصل المغناطيسي. يستفيد من مسار التداخل الخلوي ل MNPs لعزل الإندوسومات المحملة ب MNP عن طريق الفصل المغناطيسي ، يليه التجانس عالي السرعة لصياغة الإندوسومات في حويصلات نانوية أحادية التشتت. نظرا لأن أنواع الإندوسومات التي تم جمعها بواسطة هذا البروتوكول متنوعة ، فلا تزال هناك حاجة إلى مزيد من البحث المتعمق لإنشاء ممارسات تصنيع جيدة (GMP) في الصناعة. يعد نهج تحضير EM الجديد هذا أكثر كفاءة من حيث الوقت (5 دقائق من التجانس عالي السرعة) للحصول على حويصلات نانوية متماثلة مع المركبات الكهربائية الأصلية. ينتج حويصلات أكثر أضعافا مضاعفة من نفس الكميات من الخلايا مقارنة بالطرد المركزي الفائق ، والذي يمكن تطبيقه بشكل عام على أنواع مختلفة من الخلايا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: يظهر رسم تخطيطي للطريقة في الشكل 1.
1. إعداد EM والعزل
- استيعاب الخلايا ل MNPs
- زراعة الخلايا
- تعليق 1 × 106 الخلايا الجذعية الوسيطة لنخاع عظم الفئران (BMSC) ، أو الخلايا التائية 293 ، أو خلايا سرطان المبيض الظهارية للفأر (ID8) في وسط DMEM الكامل مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 5٪ محلول بنسلين ستربتومايسين (P / S) في 2 مل لكل لوحة من ستة آبار (انظر جدول المواد).
- استزرع الخلايا بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
ملاحظة: كان عدد الخلايا بعد الالتزام حوالي 1 × 106.
- البطانة الخلوية ل MNPs
- قلل الحجم المتوسط لكل لوحة من ستة آبار إلى 1 مل. شارك في استزراع الخلايا بجسيمات نانوية من أكسيد الحديد المعدل بولي ليسين 10 نانومتر (IONPs) (انظر جدول المواد) بتركيز 100 ميكروغرام / 1 × 106 خلايا واحتضانها عند 37 درجة مئوية في جو يحتوي على 5٪ CO2 لمدة 12 ساعة للسماح للخلايا ب IONPs بشكل كامل.
- زراعة الخلايا
- عزل وتجانس الإندوسومات
- علاج الخلايا منخفضة التوتر
- هضم الخلايا التي استوعبت الأيونات بالكامل مع 0.5 مل / بئر التربسين لمدة 3 دقائق ، وإنهاء الهضم بإضافة 1 مل / وسط كامل جيدا.
- أجهزة الطرد المركزي في 1000 × غرام لمدة 5 دقائق ، وتجاهل طاف . إعادة تعليق الخلايا في محلول ملحي عازل للفوسفات (PBS) وأجهزة الطرد المركزي ، بشكل متكرر مرتين لغسل الوسط المتبقي و IONPs غير الممتصة.
- أخيرا ، أعد تعليق الحبيبات في 8 مل في محلول منخفض التوتر معد مسبقا (71.4 مللي مول كلوريد البوتاسيوم ، 1.3 مللي متر سترات الصوديوم ، درجة الحموضة 7.2-7.4) لمدة 15 دقيقة (انظر جدول المواد).
- الافراج عن العضيات عن طريق التجانس منخفض السرعة
- انقل تعليق الخلية في محلول منخفض التوتر إلى أنبوب اختبار زجاجي وحرر العضيات باستخدام خالط زجاجي (انظر جدول المواد) بمقدار 20 صدمة عند 1000 دورة في الدقيقة.
- الفصل المغناطيسي للحصول على الإندوسومات
- انقل 1 مل من محلول الخلية المتجانسة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل وضعه في فاصل مغناطيسي لمدة ساعة واحدة لفصل الإندوسومات المحملة ب IONP تماما عن العضيات الأخرى (مثل النواة والميتوكوندريا) وحطام الخلية.
- اجمع الكريات البنية على سطح التلامس لأنابيب الطرد المركزي الدقيقة بجوار الإطار المغناطيسي (انظر جدول المواد) ، أي الإندوسومات المحملة ب IONP. تخلص من السائل في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة وأضف 3 مل من PBS لإعادة تعليق الإندوسومات.
- علاج الخلايا منخفضة التوتر
- تجانس عالي السرعة
- انقل المحلول الذي يحتوي على الإندوسومات إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل بحجم سائل يتراوح بين 3-10 مل.
- قم بتمديد مسبار 10 مم للخالط عالي السرعة (انظر جدول المواد) إلى أسفل أنبوب الطرد المركزي دون لمس القاع. اضبط زر السرعة أسفل الشاشة، واضبط السرعة على 140 × جم، واضبط زر الوقت لضبط الوقت على 5 دقائق، ثم اضغط على الزر موافق ( OK) .
- اضغط على زر البدء لإجراء التجانس بعد وضع صندوق ثلج أسفل العينة.
- الفرز المغناطيسي لل EMs
- انقل المحلول الذي يحتوي على حويصلات نانوية تم الحصول عليها من التجانس عالي السرعة إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل وضعه في فاصل مغناطيسي لمدة ساعة واحدة.
- اجمع السائل الذي يحتوي على EMs المطلوبة. احرص على عدم لمس سطح الأنابيب بجوار الإطار المغناطيسي ، الذي يمتص IONPs الحرة و EMs المحملة ب IONP.
2. توصيف EM (الشكل 2 والشكل 3)
- تحليل تشتت الضوء الديناميكي (DLS)
- حقن 1 مل من عينة EMs (20 ميكروغرام / مل) على طول الجدار في كوفيت ووضعها في فتحة عينة الجهاز لجهاز DLS (انظر جدول المواد).
- افتح برنامج DLS ، وحدد اختبار حجم الجسيمات ، وابدأ الاختبار.
- قم بقياس تركيز البروتين باستخدام مجموعة مقايسة بروتين BCA (انظر جدول المواد).
- تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA)
- قم بتخفيف EMs باستخدام PBS إلى محلول عند 1 × 107-1 × 108 جسيمات / مل وحقنها في غرفة أداة NTA (انظر جدول المواد) باستخدام حقنة 1 مل بمعدل تدفق 500-1000 ميكرولتر / دقيقة.
- افتح 488 قناة ليزر وتأكد من أن عدد EMs في واجهة البرنامج في حدود 100-300 وفي الحركة البراونية.
- وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة ، حدد الإجراء التشغيلي الموحد المناسب (EV-488) للتأكد من أن حساسية الجهاز مناسبة للكشف عن EM.
- المجهر الإلكتروني النافذ (TEM)
- إصلاح EMs (1 ملغ / مل) مع حجم متساو من 5 ٪ الجلوتارالدهيد لمدة 30 دقيقة ، وتحديد تركيز EMs كما 1 ملغ / مل بواسطة مجموعة فحص البروتين BCA.
- ضع قطرة 10 ميكرولتر من EMs على جانب الكربون من الشبكة النحاسية ، وقم بإزالة السائل الزائد من الجانب باستخدام ورق الترشيح بعد 10 دقائق. أضف 10 ميكرولتر من PBS وامسحها على الفور باستخدام ورق الترشيح. كرر مرتين لإزالة الجلوتارالدهيد الزائد.
- إسقاط 5 ميكرولتر من عامل تباين خلات اليورانيل وصمة عار سلبية لمدة 1 دقيقة ، ثم إزالة عامل التباين الزائد. تغسل ثلاث مرات بالماء منزوع الأيونات وتجف في درجة حرارة الغرفة (RT).
- سجل الصورة بواسطة TEM بجهد تسارع 100 كيلو فولت.
- النشاف الغربي
- أضف 100 ميكرولتر من محلول تحلل الخلية و 5 ميكرولتر من كوكتيل مثبطات الأنزيم البروتيني 50x إلى العينات (انظر جدول المواد). تخلط بلطف مع مسدس ماصة وتوضع على الجليد لمدة 30 دقيقة.
- قم بطرد المحلول عند 1000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وحدد تركيز البروتين في المادة الطافية باستخدام مجموعة فحص بروتين BCA ، وقم بجمعه.
- امزج المادة الطافية سعة 100 ميكرولتر مع 25 ميكرولتر من مخزن تحميل البروتين 5x وقم بتسخينه عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
- تحضير المواد الهلامية وفقا لتعليمات المواد الهلامية المشكلة مسبقا. قم بتحميل 15 ميكروغرام من البروتين لكل بئر وتشغيله بواسطة هلام كهربائي عند 80 فولت. انتظر حتى يتم تشغيل العينة إلى هلام الفصل ، وقم بالتغيير إلى 100 فولت ، ثم انقل البروتين إلى غشاء نيتروسليلوز عند 100 فولت ، 60 دقيقة تحت حمام جليدي.
- الكشف عن العلامات غير الخاصة ب EV (Calnexin) والمؤشرات الحيوية EV (Annexin و CD63) عن طريق النشاف الغربي (انظر جدول المواد).
ملاحظة: يتم تخفيف الأجسام المضادة وفقا لتوصيات الشركة المصنعة.
3. في المختبر EM وظيفة الكشف
- وضع العلامات EMs
- امزج 1 ميكرولتر من PKH26 مع 250 ميكرولتر من المادة المخففة C (1: 250) لعمل محلول تلطيخ 2x (4 × 10-6 M) (انظر جدول المواد).
- امزج 250 ميكرولتر من EMs (1 مجم / مل) مع 250 ميكرولتر من محلول تلطيخ 2x وانفخ بسرعة بمسدس ماصة.
- احتضان في RT لمدة 2-5 دقائق مع قلب أنبوب الطرد المركزي برفق.
- أضف كمية متساوية من المصل أو 1٪ بروتين مصل البقر واحتضانها لمدة دقيقة واحدة لإنهاء عملية الهضم.
- قم بإزالة PKH26 الزائد عن طريق الترشيح الفائق باستخدام أنابيب الترشيح الفائق 1000 دينار كويتي عند 3000 × جم لمدة 30 دقيقة ، وكرر ثلاث مرات عن طريق إضافة PBS. أعد تعليق السائل المتبقي إلى 500 ميكرولتر باستخدام PBS وقم بالتصفية من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر.
- فحص امتصاص الخلايا
- التلقيح الخلوي: البذور 1 × 106 خلايا في أطباق متحدة البؤر 35 مم مع 1 مل من DMEM تحتوي على 10٪ FBS و 5٪ P / S ، وتحضن عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 طوال الليل.
- قم بتصفية EMs باستخدام مرشحات حقنة معقمة 0.22 ميكرومتر لإزالة التلوث المحتمل.
- عالج الخلايا باستخدام EMs المسمى PKH26 (109 جسيمات / مل) لمدة 8 ساعات.
- اغسل ثلاث مرات باستخدام PBS ، وأضف DAPI (10 نانوغرام / مل) ، واحتضن لمدة 10 دقائق في RT.
- احصل على صور مضان في الفحص المجهري الفلوري للمسح بالليزر متحد البؤر باستخدام قنوات الليزر 405 نانومتر و 561 نانومتر (انظر جدول المواد).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يظهر سير عمل تحضير EM عن طريق التجانس عالي السرعة بمساعدة الفصل المغناطيسي في الشكل 1. تستوعب الخلايا 10 نانومتر من الأيونات المعدلة بالبوليسين ، والتي تتراكم على وجه التحديد في الإندوسومات عن طريق التداخل الخلوي (الشكل 3 أ). بعد معالجتها بمحلول منخفض التوتر ومتجانس ، يتم إطلاق الإندوسومات المحملة ب IONP من الخلايا ويتم جمعها لاحقا عن طريق الفصل المغناطيسي. يتم إعادة تشكيل الإندوسومات المعزولة إلى حويصلات نانوية أحادية التشتت ، والمعروفة أيضا باسم EMs ، عن طريق التجانس عالي السرعة. استكشفنا العديد من المعلمات الرئيسية (على سبيل المثال ، سرعة التجانس والوقت) لتحديد ظروف إعداد EM المثلى (الشكل 2). أخيرا ، تم اختيار سرعة التجانس البالغة 140 × جم لمدة 5 دقائق كشرط محسن من خلال النظر في حجم الجسيمات وإنتاجية EMs المنتجة. تتم إزالة IONPs المجانية و EMs المحملة ب IONP في النهاية من حل المنتج النهائي عن طريق جولة ثانية من الفصل المغناطيسي للحصول على EMs خالية من IONP. تنتج هذه الطريقة حويصلات نانوية موحدة للغاية وأحادية التشتت من إندوسومات الخلايا الأبوية ، وتشترك في نفس الأصل البيولوجي مثل EVs الأصلية.
لمقارنة المركبات الكهربائية التي تم الحصول عليها عن طريق الطرد المركزي الفائق مع EMs الناتجة عن هذه الطريقة ، تم إعداد BMSC و 293T للمركبات الكهربائية و EMs. تم تحليل قطر ومورفولوجيا EMs بواسطة NTA و TEM. يتميز مورفولوجيا BMSC-EMs بهيكل نموذجي يشبه الحويصلة على شكل وعاء ويتم تحديده بواسطة طبقة ثنائية دهنية (الشكل 3 أ). كما تم تحليلها من قبل NTA ، فإن كلا من BMSC-EMs و 293T-EMs لها قطر هيدروديناميكي مماثل للمركبات الكهربائية الأصلية (BMSC-EVs و 293T-EVs) (الشكل 3B). كانت عوائد BMSC-EMs للتجانس عالي السرعة 8.16 × 10 8-1.42 × 109/1 × 10 6 خلايا ، وكان عائد المركبات الكهربائية الأصلية المحضرة بالطرد المركزي الفائق 7.2 × 10 7-1.12 × 108/1 × 106خلايا. وبالمثل ، كانت عوائد 293T-EMs للتجانس عالي السرعة 3.71 × 10 8-7.58 × 108/1 × 10 6 خلايا ، والتي تصل إلى ما يقرب من 100 ضعف أعلى من تلك الموجودة في 293T-EVs الأصلية التي أعدتها طريقة الطرد المركزي الفائق التقليدية (≈5.5 × 10 6/1 × 10 6خلايا) (الشكل 4 أ).
علاوة على ذلك ، أظهرت نتائج النشاف الغربي أن BMSC-EMs تحتوي على نفس المؤشرات الحيوية للبروتين مثل EVs (CD63 و Annexin). كل من EMs و EVs سلبية لتعبير Calnexin ، مما يشير إلى أن EMs الناتجة عن هذه الطريقة لم يكن لها أي تلوث بغشاء البلازما تقريبا (الشكل 3C). لا يوجد فرق كبير في تركيز البروتين بين EM و EV ، أظهرت BMSC-EMs و BMSC-EVs تركيزات بروتين كلية مماثلة ، 11.15 ميكروغرام / 1 × 10 9 جسيمات و 14.71 ميكروغرام / 1 × 109 جزيئات عبر مجموعة فحص البروتين BCA. علاوة على ذلك ، أظهرت 293T-EMs و 293T-EVs تركيزات بروتين إجمالية تبلغ حوالي 31.8 ميكروغرام / 1 × 10 9 جسيمات و 9.95 ميكروغرام / 1 × 109 جسيمات ، على التوالي (الشكل 4 ب). تشير هذه النتائج إلى أن EMs لها تركيبة بروتين مماثلة للمركبات الكهربائية الأصلية. للكشف عما إذا كان يمكن استخدام EMs ، تم تحضين EMs و EVs التي تحمل علامة PKH26 مع BMSC و ID8 بتركيز 1 × 109 جسيمات / مل لمدة 8 ساعات ، وتمت ملاحظة الخلايا تحت المجهر الفلوري متحد البؤر للتأكد من أن EMs يمكن أن تمتصها الخلايا بسهولة للعمل وكذلك EVs (الشكل 5).
الشكل 1: رسم تخطيطي لطريقة التجانس عالي السرعة بمساعدة مغناطيسية. الخطوة 1: تستوعب الخلايا الأيونات إلى إندوسومات من خلال التداخل الخلوي. الخطوة 2: جمع العضيات ، بما في ذلك الإندوسومات المحملة ب IONP ، بعد العلاج الخافض للتوتر والتجانس. الخطوة 3: تنقية الإندوسومات المحملة ب IONP عن طريق الفصل المغناطيسي. الخطوة 4: يتم تجانس الإندوسومات وإعادة تشكيلها إلى حويصلات نانوية أحادية التشتت. الخطوة 5: قم بإزالة IONPs المجانية و EMs المحملة ب IONP عن طريق الفصل المغناطيسي لجمع EMs الخالية من IONP. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تحسين ظروف تحضير EM . (أ) تم تحليل قطر و PDI ل BMSC-EMs استجابة لتغيرات سرعة التجانس عند ضبط الوقت على 5 دقائق بواسطة DLS. (ب) تم تحليل قطر و PDI ل BMSC-EMs استجابة لتغيرات وقت التجانس عند ضبط سرعة التجانس على 140 × g بواسطة DLS. (ج) تم تحليل قطر و PDI ل BMSC-EMs في نقاط زمنية مختلفة للتخزين بواسطة DLS. (د) تم تحليل قطر وتركيز BMSC-EMs استجابة لتغيرات سرعة التجانس عند ضبط الوقت على 5 دقائق بواسطة NTA. (ه) تم تحليل قطر وتركيز BMSC-EMs استجابة لتغير وقت التجانس عند ضبط سرعة التجانس على 140 × جم بواسطة NTA. (و) تم تحليل قطر وإنتاجية BMSC-EMs استجابة للحضانة المشتركة لخلايا BMSC مع IONPs بتركيزات مختلفة بواسطة NTA. ص < 0.0001. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: توصيف EMs . (أ) توصيف TEM لمورفولوجيا الخلايا الأبوية باستخدام الأيونات الداخلية والإندوسومات و EMs. تمثل قضبان المقياس 500 نانومتر. (ب) تتميز الأقطار الهيدروديناميكية ل BMSC-EM ، BMSC-EV ، 293T-EM ، و 293T-EV ب NTA. (ج) نتائج تحليل اللطخة الغربية ل BMSC-EMs و BMSC-EVs و BMSC cell. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: عائد الأسواق الناشئة أعلى من المركبات الكهربائية . (أ) تم تحليل عائد EMs و EVs المحضرة من BMSC و 293T بواسطة NTA. (ب) محصول البروتين من EMs و EVs المحضرة من BMSC و 293T. ** p < 0.01. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: صور مجهر الفلورسنت التمثيلية للمركبات الكهربائية و EMs التي تحمل علامة PKH26 والتي تم استيعابها بواسطة BMSC و ID8. تمثل قضبان المقياس 10 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
كبديل للعلاج الخالي من الخلايا ونظام توصيل الأدوية النانوي ، لم تلبي المركبات الكهربائية بعد توقعاتها السريرية ، والعقبة الرئيسية هي عدم وجود طرق إنتاج وتنقية قابلة للتطوير والتكرار6. لذلك ، تم تطوير أنواع مختلفة من EMs كنظائر EV ذات تعقيد بيولوجي مماثل14. حتى الآن ، فإن المثال EM الأكثر استخداما هو الحويصلات النانوية المشتقة من غشاء بلازما الخلية. يعد تحضير هذه الحويصلات النانوية أمرا سهلا ومباشرا نسبيا عن طريق بثق الخلايا الأم الكاملة مباشرة17. ومع ذلك ، لا يمكن للحويصلات النانوية المشتقة من غشاء بلازما الخلية تلخيص EVs الأصلية بسبب عيبين: أولا ، الأصل البيولوجي لهذه الحويصلات النانوية هو من غشاء بلازما الخلية ، الذي يحتوي على تركيبات دهنية وبروتينية مختلفة مقارنة بالمركبات الكهربائية الأصلية. ثانيا ، التلوث ، بما في ذلك البروتينات والأحماض النووية والدهون من العضيات غير EV وحطام الخلايا ، مما يتسبب في عدم تجانس EM لا مفر منه. في هذه الطريقة ، قمنا بحضن الخلايا باستخدام IONPs وجمعنا الإندوسومات المحملة ب IONP من خلال الفصل المغناطيسي ، ثم أنشأنا حويصلات نانوية أحادية التشتت عبر التجانس عالي السرعة ، وفي النهاية حصلنا على EMs خالية من IONP عن طريق جولة ثانية من الفصل المغناطيسي. علاوة على ذلك ، قمنا بتحسين ظروف إعداد EM من خلال استكشاف تأثير المعلمات المختلفة ، مثل سرعة التجانس والوقت ، على حجم EM وعائده. يستفيد هذا البروتوكول من ظاهرة بيولوجية مثيرة للاهتمام: يمكن استيعاب MNPs (على سبيل المثال ، 10 نانومتر IONPs) بكفاءة من قبل جميع الخلايا تقريبا عن طريق التداخل الخلوي وتتراكم حصريا في الإندوسومات ، وليس العضيات الأخرى. مكنت هذه العملية البيولوجية الفريدة من عزل الإندوسومات المحملة ب MNP دون تلوث غير EV عن طريق الفصل المغناطيسي. في المقابل ، يمكن للحويصلات النانوية التي أعدتها هذه الإندوسومات الخلوية المنقاة أن تلخص بأمانة أكبر التعقيد البيولوجي للمركبات الكهربائية الأصلية.
علاوة على ذلك ، فإن المعيار الذهبي لطريقة عزل EV هو الطرد المركزي الفائق ، والذي يكلف وسائط زراعة الخلايا الضخمة ووقت معالجة طويل يزيد عن 5 ساعات وينتج فقط 1 × 107-1 × 108 جسيمات من 1 × 10 6 خلايا6. تتضمن طرق بثق الخلايا الأبوية الكاملة التقليدية خطوات متعددة تتضمن بثق الغشاء عالي الضغط والطرد المركزي الفائق ، والتي لها عائد أعلى نسبيا ولكنها تتطلب معدات باهظة الثمن17. ومع ذلك ، يتم تحسين عائد إنتاج EM والكفاءة والتكلفة والقوى العاملة بشكل كبير من خلال استخدام بروتوكولنا. الخالط عالي السرعة هو جهاز شائع ومنخفض التكلفة لفترة معالجة قصيرة تبلغ 5 دقائق في هذا البروتوكول ، ويمكن لهذه الطريقة إنتاج ما يصل إلى 100 مرة أكثر من EMs من 1 × 106 خلايا مقارنة بالمركبات الكهربائية الأصلية. ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة لها بعض القيود ، مثل فقدان البروتينات الاندوسومية أثناء التجانس عالي السرعة ، وقد ثبت أن MNPs التي تغذيها الخلايا يمكن نقلها إلى الجسيمات الحالة ، والتي ستكون تلوثا محتملا18.
في المنظور ، يمكن هندسة EMs لممارسة وظائف بيولوجية مهمة مثل نظيراتها الأصلية ، والتي قد تكون بمثابة نوع جديد وواعد من العلاجات البيولوجية. يمكن دمج المواد النشطة بيولوجيا (مثل البروتينات والأحماض النووية) في EMs عن طريق اختيار خلايا أبوية محددة (على سبيل المثال ، الخلايا الجذعية19) أو التعديل الوراثي (على سبيل المثال ، بروتينات الاندماج20). على سبيل المثال ، الحويصلات النانوية المشتقة من الخلايا عن طريق بثق الخلايا الجذعية الجنينية الحية لها تأثير إيجابي على عملية الشفاء أو التئام الجروح19. التعديل الوراثي هو نهج بديل لتوليد EMs ذات وظائف بيولوجية محددة. على سبيل المثال ، عندما تم نقل الخلايا بناقلات من الأجسام النانوية لمستقبلات عامل نمو البشرة (EGFR) المنصهرة في ببتيدات إشارة مرساة جليكوزيل فوسفاتيديلينوسيتول (GPI) ، يمكن تثبيت الأجسام النانوية EGFR على سطح EVs لاستهداف الخلايا السرطانية المعبرة عن EGFR20. كان أداء EMs جيدا كبديل للعلاج الخالي من الخلايا ونظام توصيل الأدوية النانوية في العديد من الدراسات قبل السريرية14 ، ولكن هناك نقص في الفهم الميكانيكي الشامل للعلاج EM أو العلاج القائم على EV مع مخاوف بشأن عدم تجانس وتكرار EVs و EMs في التحقيقات العيادية. مجتمعة ، تتطلب الوظائف البيولوجية لل EMs وآثارها السريرية مزيدا من التحقيقات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
DW و P.G. هما مخترعان مشاركان لطلب براءة اختراع مقدم من معهد الطب الأساسي والسرطان (IBMC) ، الأكاديمية الصينية للعلوم. ويعلن المؤلف الآخر عدم وجود تضارب في المصالح.
Acknowledgments
يقر المؤلفون باستخدام الأدوات في المرفق الأساسي للأجهزة المشتركة في معهد الطب الأساسي والسرطان (IBMC) ، الأكاديمية الصينية للعلوم. تم دعم هذه الدراسة من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (NSFC ؛ 82172598) ، ومؤسسة العلوم الطبيعية بمقاطعة تشجيانغ ، الصين (LZ22H310001) ، ومشروع تدريب المواهب الصحية 551 التابع للجنة الصحة بمقاطعة تشجيانغ ، الصين ، ومشروع أبحاث التنمية الزراعية والاجتماعية التابع لمكتب العلوم والتكنولوجيا في بلدية هانغتشو (2022ZDSJ0474) ومنحة Qiantang للبحوث متعددة التخصصات.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Annexin antibody | ABclonal | A11235 | Western blotting |
| BCA assay kit | Beyotime | P0012 | Protein concentration assay |
| Calnexin | GeneTex | HL1598 | Western blotting |
| CD63 antibody | ABclonal | A19023 | Western blotting |
| Cell lysis buffer for Western and IP | Beyotime | P0013 | Western blotting |
| Centrifuge | Beckman | Allegra X-30R | Cell centrifuge |
| CO2 incubator | Thermo | Cell culture | |
| Confocal laser scanning fluorescence microscopy | NIKON | A1 HD25 | Photo the fluorescence picture |
| DMEM basic (1x) | GIBCO | C11995500BT | Cell culture |
| Dynamic light scattering (DLS) | Malvern | Zetasizer Nano ZS ZEN3600 | Diameter analysis |
| Electric glass homogenizer | SCIENTZ(Ningbo, China) | DY89-II | Low-speed homogenization |
| Exosome-depleted FBS | system Bioscience | EXO-FBS-50A-1 | Cell culture |
| High-speed homogenizer | SCIENTZ(Ningbo, China) | XHF-DY | High-speed homogenization |
| Magnetic grate | Tuohe Electromechanical Technology (Shanghai, China) | NA | Magnetic separation |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich | PKH26GL-1KT | The kit contains PKH26 cell linker in ethanol and Diluent C |
| Polylysine-modified iron oxide nanoparticles (IONPs) | Zhongke Leiming Technology (Beijing, China) | Mag1100-10 | Cell culture |
| Potassium chloride | Aladdin | 7447-40-7 | Cell hypotonic treatment |
| Protease inhibitor cocktail | Beyotime | P1030 | Proteinase inhibitor |
| Sodium citrate | Aladdin | 7447-40-7 | Cell hypotonic treatment |
| Transmission electron microscopy (TEM) | JEOL | JEM-2100plus | Morphology image |
| Ultracentrifuge | Beckman | Optima XPN-100 | Exosome centrifuge |
| ZetaView nanoparticle tracking analyzers | Particle Metrix | PMX120 | Nanoparticle tracking analysis |
References
- Kalluri, R., LeBleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (6478), eaau6977 (2020).
- Hyenne, V., et al. RAL-1 controls multivesicular body biogenesis and exosome secretion. J Cell Biol. 211 (1), 27-37 (2015).
- Farooqi, A. A., et al. Exosome biogenesis, bioactivities and functions as new delivery systems of natural compounds. Biotechnol Adv. 36 (1), 328-334 (2018).
- Gatti, S., et al. Microvesicles derived from human adult mesenchymal stem cells protect against ischaemia-reperfusion-induced acute and chronic kidney injury. Nephrol Dial Transplant. 26 (5), 1474-1483 (2011).
- Zhang, Y., et al. Exosome: A review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications. Int J Nanomedicine. 15, 6917-6934 (2020).
- Yang, D., et al. Progress, opportunity, and perspective on exosome isolation - efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
- Castilletti, C., et al. Coordinate induction of IFN-alpha and -gamma by SARS-CoV also in the absence of virus replication. Virology. 341 (1), 163-169 (2005).
- Guo, P., Huang, J., Moses, M. A. Cancer nanomedicines in an evolving oncology landscape. Trends Pharmacol Sci. 41 (10), 730-742 (2020).
- Jo, W., et al.
- Yoon, J., et al. Generation of nanovesicles with sliced cellular membrane fragments for exogenous material delivery. Biomaterials. 59, 12-20 (2015).
- Li, M., et al. Exosome mimetics derived from bone marrow mesenchymal stem cells ablate neuroblastoma tumor in vitro and in vivo. Biomater Adv. 142, 213161 (2022).
- Wang, J., et al. Exosome mimetics derived from bone marrow mesenchymal stem cells deliver doxorubicin to osteosarcoma in vitro and in vivo. Drug Deliv. 29 (1), 3291-3303 (2022).
- Zhang, Z., et al. Comprehensive proteomic analysis of exosome mimetic vesicles and exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 312 (2022).
- Li, Y. J., et al. Artificial exosomes for translational nanomedicine. J Nanobiotechnology. 19 (1), 242 (2021).
- Yang, W., et al. Clinical characteristics of 310 SARS-CoV-2 Omicron variant patients and comparison with Delta and Beta variant patients in China. Virol Sin. 37 (5), 12 (2022).
- Shapira, S., et al. A novel platform for attenuating immune hyperactivity using EXO-CD24 in COVID-19 and beyond. EMBO Mol Med. 14 (9), 15997 (2022).
- Jang, S. C., et al. Bioinspired exosome-mimetic nanovesicles for targeted delivery of chemotherapeutics to malignant tumors. ACS Nano. 7 (9), 7698-7710 (2013).
- Le, T. S., et al. Quick and mild isolation of intact lysosomes using magnetic-plasmonic hybrid nanoparticles. ACS Nano. 16 (1), 885-896 (2022).
- Jeong, D., et al. Nanovesicles engineered from ES cells for enhanced cell proliferation. Biomaterials. 35 (34), 9302-9310 (2014).
- Kooijmans, S. A., et al. Display of GPI-anchored anti-EGFR nanobodies on extracellular vesicles promotes tumour cell targeting. J Extracell Vesicles. 5, 31053 (2016).
