Summary
Questo protocollo descrive la marcatura e l'iniezione di fluorescenza personalizzata basata su anticorpi negli embrioni precoci di Drosophila per consentire l'imaging dal vivo di proteine a bassa abbondanza o modifiche post-traduzionali che sono difficili da rilevare utilizzando i tradizionali approcci GFP/mCherry-tag.
Abstract
La visualizzazione delle proteine nelle cellule viventi utilizzando GFP (Green Fluorescent Protein) e altri tag fluorescenti ha notevolmente migliorato la comprensione della localizzazione, della dinamica e della funzione delle proteine. Rispetto all'immunofluorescenza, l'imaging dal vivo riflette in modo più accurato la localizzazione delle proteine senza potenziali artefatti derivanti dalla fissazione dei tessuti. È importante sottolineare che l'imaging dal vivo consente la caratterizzazione quantitativa e temporale dei livelli e della localizzazione delle proteine, fondamentali per la comprensione di processi biologici dinamici come il movimento o la divisione cellulare. Tuttavia, una delle principali limitazioni degli approcci di marcatura fluorescente è la necessità di livelli di espressione proteica sufficientemente elevati per ottenere una visualizzazione di successo. Di conseguenza, molte proteine fluorescenti marcate endogenamente con livelli di espressione relativamente bassi non possono essere rilevate. D'altra parte, l'espressione ectopica mediante promotori virali può talvolta portare a una dislocalizzazione delle proteine o ad alterazioni funzionali in contesti fisiologici. Per affrontare queste limitazioni, viene presentato un approccio che utilizza la rilevazione di proteine mediate da anticorpi altamente sensibili negli embrioni viventi, essenzialmente eseguendo l'immunofluorescenza senza la necessità di fissazione tissutale. Come prova di principio, il recettore Notch marcato endogenamente con GFP, che è appena rilevabile negli embrioni viventi, può essere visualizzato con successo dopo l'iniezione di anticorpi. Inoltre, questo approccio è stato adattato per visualizzare le modificazioni post-traduzionali (PTM) negli embrioni viventi, consentendo di rilevare cambiamenti temporali nei modelli di fosforilazione della tirosina durante l'embriogenesi precoce e rivelando una nuova sottopopolazione di fosfotirosina (p-Tyr) sotto le membrane apicali. Questo approccio può essere modificato per adattarsi ad altri anticorpi proteina-specifici, tag-specifici o PTM-specifici e dovrebbe essere compatibile con altri organismi modello o linee cellulari suscettibili di iniezione. Questo protocollo apre nuove possibilità per l'imaging dal vivo di proteine a bassa abbondanza o PTM che in precedenza erano difficili da rilevare con i tradizionali metodi di marcatura fluorescente.
Introduction
L'immunofluorescenza è una tecnica fondamentale della moderna biologia cellulare originariamente sviluppata da Albert Coons, che consente la rilevazione di molecole nei loro compartimenti cellulari nativi e la caratterizzazione delle composizioni molecolari di organelli subcellulari o macchinari1. Insieme alle manipolazioni genetiche, l'immunofluorescenza aiuta a stabilire il concetto, ormai ben accettato, che la localizzazione delle proteine è essenziale per la sua funzione2. A parte gli anticorpi primari specifici e i coloranti fluorescenti brillanti, il successo di questa tecnica si basa su un processo preliminare chiamato fissazione e permeabilizzazione, che preserva le morfologie cellulari, immobilizza gli antigeni e aumenta l'accessibilità degli anticorpi nei compartimenti intracellulari. Inevitabilmente, il processo di fissazione e permeabilizzazione ucciderebbe le cellule e porrebbe fine a tutti i processi biologici3. Pertanto, l'immunofluorescenza fornisce solo istantanee del percorso di vita delle proteine. Tuttavia, molti processi biologici come la migrazione e le divisioni cellulari sono di natura dinamica e richiedono lo studio dei comportamenti delle proteine in modo spazio-temporalmente risolto 4,5.
Per esaminare la dinamica delle proteine negli organismi viventi, sono stati sviluppati metodi di imaging dal vivo basati su proteine fluorescenti geneticamente codificate come la proteina fluorescente verde (GFP)6 e microscopi confocali ad alta velocità. In breve, la proteina di interesse può essere manipolata geneticamente per essere fusa con GFP7 e quindi espressa ectopicamente da promotori virali o di lievito come il citomegalovirus (CMV)8 o la sequenza di attivazione a monte (UAS)9. Poiché la GFP è di natura autofluorescente, non sono necessari anticorpi accoppiati a fluorofori per rivelare la localizzazione delle proteine bersaglio, il che bypassa la necessità di processi preliminari di fissazione o permeabilizzazione. Negli ultimi due decenni, sono stati sviluppati tag fluorescenti che coprono l'intero spettro della lunghezza d'onda10, consentendo l'imaging dal vivo multicolore di diverse proteine bersaglio contemporaneamente. Tuttavia, rispetto ai coloranti fluorescenti ingegnerizzati chimicamente come AlexaFluor o ATTO, l'autofluorescenza di queste proteine fluorescenti geneticamente codificate è relativamente debole e instabile quando espressa da promotori endogeni, specialmente durante l'imaging dal vivo su scale temporali più lunghe10. Mentre questa carenza può essere mitigata sovraesprimendo proteine bersaglio marcate con fluorescenza, molte con attività enzimatiche come chinasi e fosfatasi interrompono gravemente i normali processi biologici se non espresse a livelli fisiologici.
Questo protocollo presenta un metodo che consente l'illuminazione del bersaglio basata su anticorpi fotostabili in una configurazione di immagine dal vivo, consentendo essenzialmente l'immunofluorescenza senza il processo di fissazione o permeabilizzazione (Figura 1). Attraverso una semplice reazione amminica primaria basata su NHS11, è possibile coniugare coloranti fluorescenti come AlexaFluor 488 o 594 con essenzialmente qualsiasi anticorpo primario o GFP/HA/Myc nanobody12. Sfruttando una caratteristica di sviluppo che tutte le cellule embrionali di Drosophila condividono un citoplasma comune durante lo stadio13 del sincizio, è possibile ottenere il legame dell'antigene e l'illuminazione in interi embrioni dopo l'iniezione di anticorpi coniugati con coloranti. Con l'espansione delle librerie di proteine marcate endogenamente disponibili in Drosophila e in altri sistemi modello14, questo metodo può potenzialmente ampliare le applicazioni di queste librerie rivelando le dinamiche di proteine marcate fluorescenti a bassa abbondanza e di altre proteine marcate in modo fluorescente (HA/Myc-tagged) nei tessuti viventi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Gli esperimenti sono stati condotti in conformità con le linee guida e l'approvazione della School of Life Sciences dell'Università SUSTech. L'organismo utilizzato è Drosophila melanogaster, e i genotipi sono Notch-Knockin-GFP (Cromosoma X) e Sqh-sqh-GFP (Cromosoma II), generosamente forniti rispettivamente dai laboratori del Dr. Francois Schweisguth (Institute Pasteur) e della Dr.ssa Jennifer Zallen (Sloan Kettering Institute). Sebbene questo protocollo si concentri principalmente sugli aspetti della marcatura degli anticorpi e dell'imaging dal vivo, si prega di fare riferimento ai rapporti pubblicati per descrizioni più dettagliate della raccolta e dell'iniezione di embrioni di Drosophila 15,16.
1. Marcatura fluorescente degli anticorpi
- Preferibilmente, utilizzare anticorpi monoclonali o nanocorpi per la proteina di interesse. Preparare la concentrazione madre di anticorpi a 1 mg/mL o superiore.
NOTA: In questo studio, il nanocorpo GFP (vedi Tabella dei materiali) viene utilizzato come esempio. Il nanocorpo GFP disponibile in commercio è confezionato a una concentrazione di 1,0 mg/mL e un volume di 250 μL. Inoltre, viene utilizzato un kit di marcatura degli anticorpi disponibile in commercio (vedi Tabella dei materiali), che coniuga Alexa Fluor 594 alle ammine primarie delle proteine attraverso una reazione di estere succinimidilico11. È importante sottolineare che questo processo di marcatura non altera in modo significativo la concentrazione di anticorpi. - Preparare una soluzione di bicarbonato di sodio 1 M risospendendo il componente B (fornito nel kit di marcatura degli anticorpi) in 1 mL di acqua deionizzata.
- Regolare la concentrazione di anticorpi a 1,0 mg/mL, quindi aggiungere 1/10del volume ( 10 μL per 100 μL di nanocorpo GFP) della soluzione di bicarbonato di sodio 1 M.
- Aggiungere 110 μL della miscela di anticorpi (dal punto 1.3) direttamente alla provetta contenente il colorante Alexa Fluor 594. Capovolgere per mescolare (non vorticare) e incubare su un rotatore per 1 ora a temperatura ambiente.
- Assemblare la colonna di purificazione dal kit di coniugazione (vedi Tabella dei materiali). Preparare un letto di resina da 1,5 mL (fornito nel kit di marcatura degli anticorpi) e centrifugare la colonna a 1100 x g per 3 minuti a temperatura ambiente (RT) per rimuovere il liquido in eccesso dalla resina.
- Aggiungere la miscela di reazione (dal punto 1.4) goccia a goccia sulla parte superiore della colonna di resina e centrifugare a 1100 x g per 5 minuti a 4 °C per raccogliere l'anticorpo marcato. L'anticorpo raccolto deve apparire di colore rosa e il volume deve essere leggermente inferiore a 100 μL. Conservare in provette avvolte in pellicola o di colore scuro a 4 °C.
2. Preparazione degli embrioni di Drosophila
- Metti 200 Drosophila adulte appena nate in una gabbia di plastica a forma di cilindro (diametro = 5 cm, altezza = 8 cm) con un rapporto maschio-femmina di 1:10. Sigillare un lato con una rete metallica porosa per la ventilazione e l'altro lato con una piastra di agar di succo di frutta/pasta di lievito.
- Cambiare la piastra ogni 12 ore per tre giorni prima del prelievo degli embrioni. Ciò consente la sincronizzazione della deposizione delle uova di Drosophila e migliora l'efficienza della raccolta.
- Il giorno dell'iniezione, sostituire la gabbia in un piatto di succo di frutta con una quantità minima di pasta di lievito e raccogliere gli embrioni a 25 °C per 1 ora. Se il primo ciclo di raccolta non produce un numero sufficiente di embrioni (<50 embrioni), scartare la prima piastra e ripetere questa fase per un secondo ciclo di raccolta fino a quando non vengono deposti più di 100 embrioni entro 1 ora.
- Rimuovere la piastra dalla gabbia per fermare la deposizione dell'uovo e incubare a 25 °C per altre 2 ore per ottenere embrioni di 2-3 ore. Il corretto stadio degli embrioni è fondamentale per il successo dell'iniezione di anticorpi.
- Per rimuovere il guscio d'uovo degli embrioni, aggiungere 2 ml di candeggina al 50% nel piatto del succo di frutta e rimuovere delicatamente gli embrioni dal piatto usando un pennello (Figura 2A-4). Spesso, gli embrioni vengono deposti direttamente sopra la pasta di lievito. In questo caso, è accettabile spennellare la pasta di lievito nella soluzione di candeggina per raccogliere tutti gli embrioni.
- Incubare gli embrioni galleggianti in candeggina al 50% per 2 minuti e far roteare il piatto di succo di frutta ogni 30 secondi per migliorare l'efficienza della rimozione del guscio d'uovo.
- Trasferire la miscela di embrioni/candeggina versandola in un colino per celle di nylon da 70 μm (Figura 2A-7). Lavare accuratamente gli embrioni con una bottiglia d'acqua per rimuovere eventuali residui di candeggina e pasta di lievito. Asciugare completamente il colino cellulare con carta assorbente, assicurandosi che l'acqua in eccesso intorno agli embrioni venga rimossa.
3. Allineamento ed essiccazione dell'embrione
- Preparare un gel di agarosio al 4% di 5 cm x 5 cm x 0,5 cm (larghezza, lunghezza, altezza) (Figura 2A-9) e lasciare raffreddare il gel a temperatura ambiente. Tagliare un blocco di agarosio di 1 cm x 3 cm x 0,5 cm (larghezza, lunghezza, altezza) utilizzando una lametta pulita e posizionare il blocco su un vetrino (Figura 2A-2). Esaminare il blocco di gel sotto il cannocchiale di dissezione per assicurarsi che i bordi siano tagliati dritti e che la superficie sia piana e asciutta.
- Trasferire gli embrioni dal colino sul blocco di gel utilizzando un pennello. Distribuire gli embrioni in modo uniforme lungo la linea mediana del blocco spazzolando delicatamente. Idealmente, i gruppi di embrioni vengono separati in singoli embrioni o doppietti senza toccarsi.
- Preparate una pinzetta con due gambe strettamente legate insieme per creare un'unica punta sottile (Figura 2A-5). Sotto un cannocchiale da dissezione, prelevare i singoli embrioni con la pinzetta e posizionarli lungo il bordo lungo del blocco di gel. Allineare 20-30 embrioni, assicurandosi che il loro asse antero-posteriore sia parallelo al bordo (Figura 2C).
- Pipettare colla eptanica da 10 μL (vedere la tabella dei materiali) al centro di un vetrino coprioggetto da 24 mm x 50 mm (Figura 2A-1) e stendere la colla in un'area rettangolare di 0,5 cm x 3 cm utilizzando un puntale per pipetta. Attendere che la colla si asciughi completamente prima dell'uso.
- Posiziona il vetrino con il blocco di gel sul bordo della scrivania, con gli embrioni rivolti verso l'esterno. Sollevate il vetrino coprioggetto con la colla usando una pinzetta a punta piatta (Figura 2A-6) e tenetelo fermo sopra gli embrioni, con il lato della colla rivolto verso gli embrioni con un angolo inclinato di circa 45 gradi.
NOTA: Premere delicatamente il vetrino coprioggetto contro il blocco di gel in modo che gli embrioni siano a contatto con la colla, quindi rilasciare rapidamente la pressione e sollevare il vetrino coprioggetto. La quantità di tensione applicata è fondamentale in modo che gli embrioni possano essere attaccati stabilmente alla colla senza essere premuti troppo forte e scoppiare. - Pipettare 10 μL di acqua al centro di un nuovo vetrino e posizionare il vetrino coprioggetti con gli embrioni sopra di esso, con il lato dell'embrione rivolto verso l'alto (Figura 2B). Assicurati di utilizzare acqua al posto dello smalto per unghie o di altra colla adesiva per fissare il vetrino coprioggetti al vetrino, poiché questo lato del vetrino coprioggetto verrà posizionato direttamente sopra la lente confocale per l'imaging dal vivo.
- Essiccare gli embrioni in una camera di essiccazione (Figura 2A-3) (vedi Tabella dei materiali) per 10-15 minuti fino a quando la membrana vitellina non si raggrinzisce (Figura 2E). Il tempo richiesto può variare con l'umidità della stanza e deve essere testato sperimentalmente per ogni condizione di laboratorio.
- Pipettare 40 μL di olio di alocarburi (una miscela di tipo 27 e tipo 700 in volume 1:1, vedi tabella dei materiali) a un'estremità della striscia embrionale. Inclinare il vetrino fino a quando l'olio di alocarburi copre l'intera superficie degli embrioni.
4. Iniezione di anticorpi e imaging
- Preparare alcuni aghi di vetro per iniezione utilizzando un estrattore per micropipette (vedere la Tabella dei materiali per le impostazioni dei parametri) e caricare ciascun ago con 5 μL di soluzione anticorpale marcata con AlexaFluor (dal punto 1.6).
- Posizionare un vetrino coprioggetti da 25 mm x 25 mm sopra un vetrino. Pipettare 40 μL di olio di alocarburi e distribuirlo lungo il bordo del vetrino coprioggetto.
- Sotto l'endoscopio di iniezione, allineare la punta dell'ago contro il bordo del vetrino coprioggetto sotto l'olio. Regolare la pressione dell'aria di iniezione della picopompa (vedere Tabella dei materiali) in modo che una pompa generi una bolla piena di anticorpi. Il diametro della bolla deve essere limitato a 20-50 μm (Figura 2F).
- Sostituisci il vetrino vuoto con uno contenente embrioni sott'olio. Allineare perpendicolarmente la punta dell'ago per iniezione contro l'asse antero-posteriore degli embrioni (Figura 2D,G).
- Controllare lo stadio degli embrioni per assicurarsi che la maggior parte abbia iniziato la cellularizzazione ma non abbia ancora iniziato la gastrulazione (stadio 4 e stadio 5), rimanendo come un sincizio (Figura 2F,G).
NOTA: Il segno distintivo di questa fase è l'assenza di scanalature o pieghe e la presenza di un sacco vitellino di forma ovale, di colore scuro, visibile al centro dell'embrione. La caratterizzazione morfologica dello stadio embrionale sott'olio si basa sul capitolo del libro "Stages of Drosophila Embryogenesis" di Volker Hartenstein17. - Utilizzare il manipolatore dello stadio X-Y per spostare gli embrioni verso l'ago fino a quando la punta non arriva al centro del tuorlo. Pompare due o tre volte per iniettare gli anticorpi nel tuorlo. Il successo dell'iniezione è indicato dalla rapida scomparsa della ruga della membrana vitellina mentre gli embrioni guadagnano volume dalla soluzione anticorpale (Figura 2G).
- Utilizzare il manipolatore dello stadio X-Y per allontanare gli embrioni dall'ago dopo l'iniezione e spostarli verso il basso fino all'embrione successivo. Ripetere il passaggio 6 fino a quando tutti gli embrioni sul vetrino non sono stati iniettati.
- Trasferire il vetrino con gli embrioni iniettati in una camera di umidità (Figura 2A-8). Incubare a 25 °C fino al raggiungimento dello stadio di sviluppo embrionale desiderato.
- Sollevare il vetrino coprioggetti da 24 mm x 50 mm dal vetrino e inserirlo direttamente nel supporto per vetrini del microscopio. La parte senza embrioni affronterà gli obiettivi. Individua gli embrioni utilizzando una lente a basso ingrandimento sotto l'illuminazione in campo chiaro e passa a una lente 40x o 63x per l'imaging fluorescente dal vivo ad alta risoluzione.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Per dimostrare i vantaggi del metodo di iniezione degli anticorpi rispetto all'imaging dal vivo basato su tag fluorescenti o all'immunofluorescenza, vengono forniti due casi di studio che caratterizzano la localizzazione dinamica di un recettore transmembrana a bassa abbondanza, Notch, e un tipo di modificazione post-traduzionale chiamata fosforilazione della tirosina negli embrioni viventi.
L'attività di segnalazione di Notch svolge un ruolo importante nella determinazione del destino cellulare durante l'embriogenesi e l'omeostasi degli organi adulti18,19. Dopo l'attivazione da parte dei suoi ligandi Delta/Jagged20, il dominio intracellulare del recettore transmembrana Notch viene scisso e rilasciato nel nucleo21, avviando programmi trascrizionali a valle per guidare i cambiamenti del destino cellulare22. La localizzazione statica del recettore Notch è stata ben caratterizzata dall'immunofluorescenza nei tessuti fissati con formaldeide. Tuttavia, la localizzazione dinamica di Notch durante il legame del ligando o il processo di scissione intracellulare rimane in gran parte sconosciuta23, a causa della mancanza di un metodo per l'imaging dal vivo di questa proteina relativamente a bassa abbondanza in modo ad alta velocità. Qui, abbiamo iniettato nanocorpi GFP coniugati con AlexaFluor in embrioni che esprimono Notch marcato con GFP dal locusendogeno 20. Senza iniezione, Notch-GFP è a malapena rilevabile in condizioni standard di imaging dal vivo e il segnale fluorescente sbianca rapidamente durante l'imaging time-lapse. Dopo l'iniezione, il rapporto segnale/rumore del recettore Notch migliora significativamente, paragonabile alla qualità del segnale dell'immunofluorescenza (Figura 3A). Inoltre, l'iniezione di anticorpi consente la caratterizzazione temporale della localizzazione di Notch a intervalli di 45 s, senza un'apparente perdita di intensità del segnale in una finestra di imaging di 5 minuti (Figura 3B).
La fosforilazione della tirosina è un tipo importante di modificazione post-traduzionale della proteina che media la trasduzione del segnale in molte vie biologiche24. Sono stati sviluppati anticorpi monoclonali altamente specifici (come PY20 e 4G10) contro la fosfotirosina (p-Tyr) per caratterizzare la localizzazione e i livelli di fosforilazione complessiva della tirosina utilizzando l'immunofluorescenza e i western blot25. Sebbene nessun tag fluorescente possa tracciare i cambiamenti di fosforilazione, i tessuti o le cellule devono essere fissati e colorati o lisati e tamponati in diversi punti temporali per fornire istantanee dello stato di fosforilazione nel tempo, per studiare la cinetica della fosforilazione della tirosina all'attivazione del segnale26 (ad esempio, il trattamento con fattore di crescita). L'intervallo di tempo di questo approccio è di almeno alcuni minuti e intrinsecamente impreciso a causa del tempo variabile richiesto per procedure come la fissazione o la lisi cellulare.
Qui, viene presentata la prova che il metodo di iniezione degli anticorpi consente la visualizzazione diretta dello stato di fosforilazione negli embrioni viventi, monitorando la localizzazione e le variazioni di intensità della fosforilazione della tirosina a intervalli di tempo regolari, a livello di secondi. L'anticorpo PY20 coniugato con AlexaFluor è stato iniettato in embrioni che esprimevano una catena leggera di miosina marcata con GFP ed ha eseguito l'imaging dal vivo a due colori a intervalli di 45 s. Come è stato mostrato in precedenza, la fosforilazione della tirosina è altamente arricchita a livello delle giunzioni tricellulari27, un modello che viene anche ricapitolato dall'immunofluorescenza (Figura 4A). È interessante notare che l'imaging dal vivo ha anche rivelato una nuova seconda popolazione di segnale p-Tyr sotto il centro della membrana apicale, che non viene osservata utilizzando l'immunofluorescenza (Figura 4B). Attraverso l'imaging a due colori, è stato scoperto che questa popolazione di segnale p-Tyr è in prossimità della miosina mediale (Figura 4B, primi piani), una sottopopolazione di miosina28 che è similmente pronunciata solo in condizioni di imaging dal vivo, ma a malapena rilevabile utilizzando l'immunofluorescenza. Inoltre, la popolazione mediale di p-Tyr mostra modelli di coalescenza e dissipazione pulsatile simili (Figura 4C), come mostrato in precedenza per la miosina28 mediale. L'identità e la funzione di una sottopopolazione mediale di p-Tyr sono ancora sconosciute. Insieme, questi risultati dimostrano che il metodo di iniezione degli anticorpi potrebbe integrare notevolmente gli approcci tradizionali per caratterizzare i comportamenti delle proteine a bassa abbondanza e rivelare nuovi modelli di localizzazione che potrebbero essere stati interrotti durante il processo di immunofluorescenza.
Figura 1: Flusso di lavoro per l'iniezione di anticorpi. Flusso di lavoro schematico che illustra le fasi coinvolte nel metodo di iniezione degli anticorpi. L'intero processo, dalla raccolta degli embrioni all'iniezione degli anticorpi, richiede in genere circa 4-5 ore per essere completato. Dopo l'iniezione di anticorpi, gli embrioni possono essere incubati in una camera umida fino allo stadio di sviluppo desiderato prima dell'imaging dal vivo. AEL, dopo la deposizione delle uova; RT, temperatura ambiente; Ab, anticorpo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Allineamento e iniezione dell'embrione. (A) Panoramica degli elementi necessari prima dell'iniezione, tra cui un vetrino, un vetrino, una scatola di essiccazione, un pennello, una pinzetta, un colino cellulare, una camera di umidità e un gel di agarosio. (B) Embrioni allineati attaccati alla colla eptanica al centro del vetrino coprioggetto e posti sopra le perline di essiccazione. (C) Allineamento dell'asse antero-posteriore degli embrioni in parallelo con il bordo del gel di agarosio. (D) Panoramica della configurazione dell'iniezione. (E) Confronto della morfologia embrionale prima e dopo il processo di essiccazione, con particolare attenzione alla ruga della membrana vitellina dopo l'essiccazione. (F) Dimensione della bolla di iniezione dopo una singola pressione della picopompa. (G) Confronto della morfologia embrionale prima e dopo l'iniezione di anticorpi, evidenziando la scomparsa delle rughe di membrana dopo l'iniezione. (E-G) sono stati catturati con un obiettivo con ingrandimento 10x utilizzando la microscopia in campo chiaro. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Imaging dal vivo del recettore di Notch negli embrioni precoci. (A) Localizzazione del recettore Notch marcato endogenamente con GFP attraverso l'immunofluorescenza (a sinistra), l'imaging diretto dal vivo basato sull'autofluorescenza GFP (al centro) e l'iniezione di nanocorpi GFP coniugati con AlexaFluor 594 (a destra). (B) Localizzazione dinamica di Notch-GFP ripresa a intervalli di 45 secondi dopo l'iniezione dell'anticorpo. Tutte le immagini sono state acquisite con la parte anteriore degli embrioni a sinistra e il lato ventrale rivolto verso il basso. Barre di scala = 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Imaging dal vivo dei pattern embrionali di fosfotirosina. (A) Localizzazione della tirosina fosforilata (p-Tyr) in embrioni fissi mediante immunofluorescenza. (B) Localizzazione di p-Tyr (magenta) in embrioni vivi che esprimono la catena leggera della miosina marcata con GFP (verde). Il riquadro bianco tratteggiato indica viste ravvicinate della popolazione mediale di fosfotirosina e miosina sotto la membrana apicale. Barre di scala = 10 μm. (C) Localizzazione di p-Tyr e GFP-miosina visualizzata ogni 45 s in embrioni vivi. Le frecce bianche indicano la popolazione mediale di p-Tyr e miosina. Tutte le immagini sono state catturate con la parte anteriore degli embrioni a sinistra e il lato ventrale rivolto verso il basso. Barre di scala = 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Questa procedura presentata delinea il metodo specializzato di marcatura a fluorescenza con anticorpi personalizzati e successiva iniezione in embrioni di Drosophila in fase iniziale. Questa tecnica facilita la visualizzazione in tempo reale di proteine o modificazioni post-traduzionali che esistono in piccole quantità e sono in genere difficili da osservare attraverso i metodi convenzionali di marcatura GFP/mCherry.
Occorre prestare attenzione quando si estende questo metodo per effettuare confronti quantitativi tra embrioni wild-type e embrioni mutanti. Mentre la concentrazione di anticorpi primari e secondari può essere mantenuta invariata tra i gruppi di controllo e sperimentali in immunofluorescenza, la quantità di anticorpi iniettati e l'efficienza di marcatura potrebbero variare tra gli embrioni. Pertanto, l'analisi quantitativa dovrebbe essere limitata al monitoraggio delle variazioni di intensità fluorescente nel tempo o alla conduzione di analisi di correlazione con segnali di altri canali nello stesso embrione durante l'esecuzione di imaging dal vivo multicolore. Ad esempio, l'analisi di colocalizzazione e correlazione può essere eseguita utilizzando le intensità di p-Tyr e miosina27, mentre le intensità di p-Tyr non possono essere confrontate direttamente tra embrioni wild-type e gene-X knockdown utilizzando il metodo di iniezione di anticorpi.
Analogamente ad altri approcci basati su tag fluorescenti per esaminare la dinamica delle proteine, il legame degli anticorpi potrebbe potenzialmente alterare l'attività, il traffico o la localizzazione delle proteine bersaglio. Pertanto, gli anticorpi monoclonali o nanocorpi sono preferiti agli anticorpi policlonali per iniezione. Poiché gli epitopi degli anticorpi monoclonali o dei nanocorpi sono ben definiti, è stato possibile modellare se il blocco di questi epitopi con anticorpi alteri l'attività proteica sulla base di strutture alfa-fold12,25. D'altra parte, gli epitopi degli anticorpi policlonali non sono delineati con precisione e il loro legame potrebbe potenzialmente alterare la localizzazione o l'attività delle proteine se le tasche catalitiche o i peptidi segnale delle proteine bersaglio vengono bloccati. In secondo luogo, gli anticorpi sono in grado di riconoscere epitopi non specifici diversi dalle proteine bersaglio, soprattutto considerando che non ci sono passaggi di "washout" qui, come nell'immunofluorescenza, per rimuovere i legami non specifici a bassa affinità. Pertanto, è importante avere gruppi di controllo, come l'iniezione di anticorpi in cellule prive dell'epitopo, per verificare se il segnale osservato riflette veramente le proteine bersaglio o altri epitopi non specifici.
L'iniezione di anticorpi non è diversa dall'iniezione di siRNA o gRNA CRISPR in termini di configurazione sperimentale. Pertanto, la maggior parte dei sistemi cellulari suscettibili di iniezioni dovrebbe essere compatibile con il metodo di iniezione degli anticorpi. Negli embrioni di Drosophila , gli anticorpi coniugati con Alexa Fluor sono stabili durante lo sviluppo e i segnali fluorescenti rimangono rilevabili dopo ore di embriogenesi. Per altri sistemi, come gli embrioni di Xenopus o Zebrafish, la concentrazione e il volume di iniezione degli anticorpi devono essere testati empiricamente attraverso diluizioni seriali per ottenere un'efficienza di marcatura ideale. Inoltre, coloranti fluorescenti alternativi come l'ATTO10 potrebbero potenzialmente offrire un migliore rapporto segnale/rumore e solubilità in acqua.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare la Dott.ssa Jennifer A. Zallen per aver fornito la linea Sqh-GFP Drosophila e il supporto per lo sviluppo iniziale di questa tecnica, e il Dr. Francois Schweisguth per aver fornito la linea Notch-GFP Drosophila . Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti della National Natural Science Foundation of China (32270809) a H.H.Yu, generoso sostegno finanziario e personale da parte della School of Life Sciences, SUSTech, e da finanziamenti a Y. Yan da parte della Shenzhen Science and Technology Innovation Commission/JCYJ20200109140201722.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sangon Biotech | A620014 | |
| Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit | Invitrogen | A20185 | Purification column from step 1.6 is included in this kit |
| Biological Microscope | SOPTOP | EX20 | Eyepiece lens: PL 10X/20. Objective lens: 10x/0.25 |
| Bleach | Clorox® | ||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5245 | |
| Cell Strainer | FALCON | 352350 | |
| Desiccation chamber | LOCK&LOCK | HSM8200 | 320ml |
| Dissecting Microscope | Mshot | MZ62 | Eyepiece lens: WF10X/22mm. |
| Double-sided Tape | Scotch | 665 | |
| Fine Super Tweezer | VETUS | ST-14 | |
| Fisherbrand™ Cover Glasses: Rectangles | Fisherbrand | 12-545F | |
| Fisherbrand™ Superfrost™ Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Forcep | VETUS | 33A-SA | |
| Halocarbon oil 27 | Sigma-Aldrich | H8773-100ML | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898-100ML | |
| Heptane | Sigma-Aldrich | H2198-1L | Heptane glue is made of double-sided tape immersed in heptane |
| Dehydration reagent | TOKAI | 1-7315-01 | Fill to 90% volume of the dessication chamber |
| Manual Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
| Micropipette puller | World Precision Instruments | PUL-1000 | Procedure: step 1, Heat: 290, Force:300, Distance:1.00, Delay:50. Step 2, Heat: 290, Force:300, Distance:2.21, Delay:50 |
| Pneumatic picopump | World Precision Instruments | PV 830 | Eject: 20 psi; Range: 100ms; Duration: timed |
| PY20 | Santa Cruz | SC-508 | |
| Square petri dishes | Biosharp | BS-100-SD | |
| GFP nanobody | Chromotek | gt |
References
- Coons, A. H.
- Arthur, G., et al.
- Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H.
- Ragkousi, K., Gibson, M. C. Epithelial integrity and cell division: Concerted cell cycle control. Cell Cycle. 17 (4), 399-400 (2018).
- Herszterg, S., Leibfried, A., Bosveld, F., Martin, C., Bellaiche, Y. Interplay between the dividing cell and its neighbors regulates adherens junction formation during cytokinesis in epithelial tissue. Developmental Cell. 24 (3), 256-270 (2013).
- Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, aequorea. Journal of Cellular and Comparative Physiology. 59 (3), 223-239 (1962).
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
- Boshart, M., et al. A very strong enhancer is located upstream of an immediate early gene of human cytomegalovirus. Cell. 41 (2), 521-530 (1985).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Rodriguez, E. A., et al. The growing and glowing toolbox of fluorescent and photoactive proteins. Trends in Biochemical Sciences. 42 (2), 111-129 (2016).
- Berg, E. A., Fishman, J. B. Labeling antibodies using N -Hydroxysuccinimide (NHS)-fluorescein. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (3), (2019).
- Saerens, D., et al. Identification of a universal VHH framework to graft non-canonical antigen-binding loops of camel single-domain antibodies. Journal of Molecular Biology. 352 (3), 597-607 (2005).
- Loncar, D., Singer, S. J. Cell membrane formation during the cellularization of the syncytial blastoderm of Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (6), 2199-2203 (1995).
- Lye, C. M., Naylor, H. W., Sanson, B. Subcellular localisations of the CPTI collection of YFP-tagged proteins in Drosophila embryos. Development. 141 (20), 4006-4017 (2014).
- Iordanou, E., Chandran, R. R., Blackstone, N., Jiang, L. RNAi interference by dsRNA injection into Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. 50, e2477 (2011).
- Figard, L., Sokac, A. M. Imaging cell shape change in living Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. 49, e2503 (2011).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. The embryonic development of Drosophila melanogaster. , 9-102 (1997).
- Ho, D. M., Artavanis-Tsakonas, S.
- Kopan, R., Ilagan,, Ma, X. G. The canonical Notch signaling pathway: unfolding the activation mechanism. Cell. 137 (2), 216-233 (2009).
- Fehon, R. G., et al. Molecular interactions between the protein products of the neurogenic loci Notch and Delta, two EGF-homologous genes in Drosophila. Cell. 61 (3), 523-534 (1990).
- Struhl, G., Greenwald, I. Presenilin is required for activity and nuclear access of Notch in Drosophila. Nature. 398 (6727), 522-525 (1999).
- Henrique, D., Schweisguth, F. Mechanisms of Notch signaling: a simple logic deployed in time and space. Development. 146 (3), dev172148 (2019).
- Trylinski, M., Mazouni, K., Schweisguth, F. Intra-lineage fate decisions involve of notch receptors basal to the midbody in drosophila sensory organ precursor cells. Current Biology. 27 (15), 2239.e3-2247.e3 (2017).
- Hunter, T. Protein kinases and phosphatases: The Yin and Yang of protein phosphorylation and signaling. Cell. 80 (2), 225-236 (1995).
- Glenney, J. R., Zokas, L., Kamps, M. P.
- Hunter, T., Cooper, J. A. Epidermal growth factor induces rapid tyrosine phosphorylation of proteins in A431 human tumor cells. Cell. 24 (3), 741-752 (1981).
- Yu, H. H., Zallen, J. A. Abl and Canoe/Afadin mediate mechanotransduction at tricellular junctions. Science. 370 (6520), eaba5528 (2020).
- Martin, A. C., Kaschube, M., Wieschaus, E. F. Pulsed contractions of an actin–myosin network drive apical constriction. Nature. 457 (7228), 495-499 (2009).
