Summary
Detta protokoll beskriver den skräddarsydda antikroppsbaserade fluorescensmärkningen och injektionen i tidiga Drosophila-embryon för att möjliggöra levande avbildning av proteiner med låg förekomst eller posttranslationella modifieringar som är utmanande att upptäcka med traditionella GFP/mCherry-tag-metoder.
Abstract
Visualisering av proteiner i levande celler med hjälp av GFP (Green Fluorescent Protein) och andra fluorescerande taggar har avsevärt förbättrat förståelsen för proteinlokalisering, dynamik och funktion. Jämfört med immunofluorescens återspeglar live-avbildning mer exakt proteinlokalisering utan potentiella artefakter som uppstår vid vävnadsfixering. Viktigt är att live-avbildning möjliggör kvantitativ och tidsmässig karakterisering av proteinnivåer och lokalisering, vilket är avgörande för att förstå dynamiska biologiska processer som cellrörelse eller celldelning. En stor begränsning för fluorescerande märkningsmetoder är dock behovet av tillräckligt höga proteinuttrycksnivåer för att uppnå framgångsrik visualisering. Följaktligen kan många endogent märkta fluorescerande proteiner med relativt låga uttrycksnivåer inte detekteras. Å andra sidan kan ektopiskt uttryck med hjälp av virala promotorer ibland leda till fellokalisering av proteiner eller funktionella förändringar i fysiologiska sammanhang. För att ta itu med dessa begränsningar presenteras ett tillvägagångssätt som använder mycket känslig antikroppsmedierad proteindetektion i levande embryon, vilket i huvudsak utför immunofluorescens utan behov av vävnadsfixering. Som principbevis kan endogent GFP-märkt Notch-receptor som knappt är detekterbar i levande embryon framgångsrikt visualiseras efter antikroppsinjektion. Dessutom anpassades detta tillvägagångssätt för att visualisera posttranslationella modifieringar (PTM) i levande embryon, vilket gör det möjligt att upptäcka tidsmässiga förändringar i tyrosinfosforyleringsmönster under tidig embryogenes och avslöja en ny subpopulation av fosfotyrosin (p-Tyr) under apikala membran. Detta tillvägagångssätt kan modifieras för att rymma andra proteinspecifika, taggspecifika eller PTM-specifika antikroppar och bör vara kompatibelt med andra injektionsvänliga modellorganismer eller cellinjer. Detta protokoll öppnar nya möjligheter för live-avbildning av proteiner med låg förekomst eller PTM:er som tidigare var utmanande att upptäcka med traditionella fluorescerande märkningsmetoder.
Introduction
Immunofluorescens är en hörnstensteknik i modern cellbiologi som ursprungligen utvecklades av Albert Coons, som möjliggör detektion av molekyler vid deras ursprungliga cellulära fack och karakterisering av de molekylära sammansättningarna av subcellulära organeller eller maskineri1. Tillsammans med genetiska manipulationer hjälper immunofluorescens till att etablera det nu väl accepterade konceptet att proteinlokalisering är avgörande för dess funktion2. Bortsett från specifika primära antikroppar och ljusa fluorescerande färgämnen, beror framgången för denna teknik på en preliminär process som kallas fixering och permeabilisering, som bevarar cellulära morfologier, immobiliserar antigener och ökar tillgängligheten av antikroppar i intracellulära fack. Oundvikligen skulle fixerings- och permeabiliseringsprocessen döda celler och avsluta alla biologiska processer3. Därför ger immunofluorescens bara ögonblicksbilder av proteiners livsresa. Många biologiska processer, såsom cellmigration och celldelning, är dock dynamiska till sin natur, vilket kräver undersökning av proteinbeteenden på ett rumsligt-tidsmässigt upplöst sätt 4,5.
För att undersöka proteindynamik i levande organismer har levande avbildningsmetoder baserade på genetiskt kodade fluorescerande proteiner såsom grönt fluorescerande protein (GFP)6 och höghastighetskonfokalmikroskop utvecklats. Kortfattat kan proteinet av intresse manipuleras genetiskt för att smältas samman med GFP7 och sedan uttryckas ektopiskt från virus- eller jästpromotorer såsom cytomegalovirus (CMV)8 eller uppströms aktiveringssekvens (UAS)9. Eftersom GFP är autofluorescerande till sin natur krävs inga fluoroforkopplade antikroppar för att avslöja lokaliseringen av målproteiner, vilket kringgår behovet av preliminära processer för fixering eller permeabilisering. Under de senaste två decennierna har fluorescerande taggar som spänner över hela spektrumet av våglängder utvecklats10, vilket möjliggör flerfärgad live-avbildning av flera målproteiner samtidigt. Jämfört med kemiskt framställda fluorescerande färgämnen som AlexaFluor eller ATTO är dock autofluorescensen hos dessa genetiskt kodade fluorescerande proteiner relativt svag och instabil när den uttrycks från endogena promotorer, särskilt under live-avbildning över längre tidsskalor10. Även om denna brist kan mildras genom överuttryck av fluorescerande märkta målproteiner, stör många med enzymatisk aktivitet såsom kinaser och fosfataser allvarligt normala biologiska processer om de inte uttrycks på fysiologiska nivåer.
Detta protokoll presenterar en metod som möjliggör fotostabil antikroppsbaserad målbelysning i en livebildsuppställning, vilket i huvudsak möjliggör immunofluorescens utan fixering eller permeabilisering (figur 1). Genom en enkel NHS-baserad primär aminreaktion11 kan man konjugera fluorescerande färgämnen som AlexaFluor 488 eller 594 med i stort sett vilken primär antikropp som helst eller GFP/HA/Myc nanobody12. Genom att dra nytta av en utvecklingsegenskap att alla Drosophila-embryonala celler delar en gemensam cytoplasma under syncytiumstadium13, kan man uppnå antigenbindning och belysning över hela embryon efter injektion av färgkonjugerade antikroppar. Med växande bibliotek av endogent märkta proteiner tillgängliga i Drosophila och andra modellsystem14, kan denna metod potentiellt bredda tillämpningarna av dessa bibliotek genom att avslöja dynamiken hos fluorescerande märkta proteiner med låg förekomst och andra icke-fluorescerande märkta (HA/Myc-märkta) proteiner i levande vävnader.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Experimenten utfördes i enlighet med riktlinjerna och godkännandet från School of Life Sciences, SUSTech University. Organismen som används är Drosophila melanogaster, och genotyperna är Notch-Knockin-GFP (kromosom X) och Sqh-sqh-GFP (kromosom II), generöst tillhandahållna av laboratorierna Dr. Francois Schweisguth (Institute Pasteur) respektive Dr. Jennifer Zallen (Sloan Kettering Institute). Även om detta protokoll huvudsakligen fokuserar på aspekter av antikroppsmärkning och avbildning av levande organismer, se publicerade rapporter för mer detaljerade beskrivningar av insamling och injektion av Drosophila-embryon 15,16.
1. Fluorescerande märkning av antikroppar
- Använd helst monoklonala antikroppar eller nanokroppar för proteinet av intresse. Bered stamkoncentrationen av antikroppar till 1 mg/ml eller högre.
OBS: I denna studie används GFP nanobody (se Materialförteckning) som exempel. Den kommersiellt tillgängliga GFP-nano förpackas i en koncentration av 1,0 mg/ml och en volym av 250 μL. Dessutom används ett kommersiellt tillgängligt antikroppsmärkningskit (se materialtabell), som konjugerar Alexa Fluor 594 till primära aminer av proteiner genom en succinimidylesterreaktion11. Det är viktigt att notera att denna märkningsprocess inte förändrar antikroppskoncentrationen nämnvärt. - Bered en 1 M natriumbikarbonatlösning genom att återsuspendera komponent B (medföljer antikroppsmärkningssatsen) i 1 ml avjoniserat vatten.
- Justera antikroppskoncentrationen till 1,0 mg/ml och tillsätt sedan 1/10volym (10 μL för 100 μL GFP-nanokropp) av 1 M natriumbikarbonatlösningen.
- Tillsätt 110 μL av antikroppsblandningen (från steg 1.3) direkt till tuben som innehåller Alexa Fluor 594-färgämnet. Invertera för att blanda (virvla inte) och inkubera på en rotator i 1 timme vid rumstemperatur.
- Montera reningskolonnen från konjugeringssatsen (se materialförteckning). Förbered en 1,5 ml hartsbädd (medföljer antikroppsmärkningssatsen) och centrifugera kolonnen vid 1100 x g i 3 minuter vid rumstemperatur (RT) för att avlägsna överflödig vätska från hartset.
- Tillsätt reaktionsblandningen (från steg 1.4) droppvis till toppen av hartskolonnen och centrifugera vid 1100 x g i 5 minuter vid 4 °C för att samla upp den märkta antikroppen. Den uppsamlade antikroppen ska vara rosa till färgen och volymen ska vara något mindre än 100 μL. Förvaras i folieförpackade eller mörkfärgade rör vid 4 °C.
2. Beredning av Drosophila-embryon
- Placera 200 nykläckta vuxna Drosophila i en cylinderformad plastbur (diameter = 5 cm, höjd = 8 cm) med ett han-till-hona-förhållande på 1:10. Försegla ena sidan med poröst metallnät för ventilation och den andra sidan med en fruktjuice/jäst-pasta-agarplatta.
- Byt platta var 12:e timme i tre dagar före embryoinsamling. Detta möjliggör synkronisering av Drosophilas äggläggning och förbättrar insamlingseffektiviteten .
- På injektionsdagen byts buren till en fruktjuicetallrik med minimal jästpasta och embryona samlas in vid 25 °C i 1 timme. Om den första insamlingsomden inte ger tillräckligt många embryon (<50 embryon), kassera den första plattan och upprepa detta steg för en andra insamlingsomgång tills mer än 100 embryon har värpts inom 1 timme.
- Ta bort plattan från buren för att stoppa äggläggningen och ruva vid 25 °C i ytterligare 2 timmar för att få embryon som är 2-3 timmar gamla. Rätt stadium av embryon är avgörande för att antikroppsinjektionen ska lyckas.
- För att ta bort äggskalet från embryon, tillsätt 2 ml 50 % blekmedel på fruktjuiceplattan och lossa försiktigt embryon från plattan med en pensel (Figur 2A-4). Ofta läggs embryon direkt ovanpå jäspastan. I det här fallet är det acceptabelt att borsta jästpastan i blekmedelslösningen för att samla in alla embryon.
- Ruva de flytande embryona i 50 % blekmedel i 2 minuter och snurra fruktjuiceplattan var 30:e sekund för att förbättra effektiviteten vid avlägsnandet av äggskal.
- Överför blandningen av embryo och blekmedel genom att hälla den i en 70 μm nyloncellssil (figur 2A-7). Tvätta embryona noggrant med en vattenflaska för att ta bort eventuella rester av blekmedel och jäspasta. Torka cellsilen helt med hushållspapper och se till att överflödigt vatten runt embryona avlägsnas.
3. Embryoanpassning och uttorkning
- Förbered en 5 cm x 5 cm x 0.5 cm (bredd, längd, höjd) 4% agarosgel (Figur 2A-9) och låt gelen svalna till rumstemperatur. Skär ett agarosblock på 1 cm x 3 cm x 0,5 cm (bredd, längd, höjd) med ett rent rakblad och placera blocket på en glasskiva (Figur 2A-2). Undersök gelblocket under dissekeringsskopet för att säkerställa att kanterna skärs rakt och att ytan är plan och torr.
- Överför embryon från silen till gelblocket med hjälp av en pensel. Sprid ut embryona jämnt längs blockets mittlinje genom att borsta försiktigt. Helst separeras kluster av embryon i enkla eller dubbla utan att röra vid varandra.
- Förbered en pincett med två ben tejpade tätt ihop för att skapa en enda fin spets (Figur 2A-5). Under ett dissekerande kikarsikte plockar du upp enskilda embryon med pincetten och placerar dem längs gelblockets långsida. Rikta in 20-30 embryon och se till att deras främre-bakre axel är parallell med kanten (Figur 2C).
- Pipettera 10 μL heptanlim (se Materialtabell) i mitten av ett 24 mm x 50 mm täckglas (Figur 2A-1) och sprid ut limmet i ett 0,5 cm x 3 cm rektangulärt område med hjälp av en pipettspets. Vänta tills limmet har torkat helt innan du använder det.
- Placera glasglaset med gelblocket vid kanten av skrivbordet, med embryona vända utåt. Lyft täckglaset med lim med en platt pincett (Figur 2A-6) och håll det stilla ovanpå embryona, med limsidan vänd mot embryona i en lutande vinkel på cirka 45 grader.
OBS: Tryck försiktigt täckglaset mot gelblocket så att embryona kommer i kontakt med limmet, och släpp sedan snabbt trycket och lyft täckglaset. Mängden spänning som appliceras är avgörande så att embryon kan fästas stabilt på limmet utan att pressas för hårt och spricka. - Pipettera 10 μL vatten i mitten av ett nytt glasglas och placera täckglaset med embryona ovanpå, med embryots sida vänd uppåt (figur 2B). Se till att använda vatten istället för nagellack eller annat självhäftande lim för att fästa täckglaset på glasglaset, eftersom denna sida av täckglaset kommer att placeras direkt ovanpå den konfokala linsen för levande bildbehandling.
- Torka embryona i en uttorkningskammare (Figur 2A-3) (se Materialtabell) i 10-15 minuter tills vitellinmembranet skrynklas (Figur 2E). Den tid som krävs kan variera med luftfuktigheten i rummet och bör testas experimentellt för varje laboratorietillstånd.
- Pipettera 40 μl halokarbonolja (en blandning av typ 27 och typ 700 i volymförhållandet 1:1, se materialtabell) i ena änden av embryoremsan. Luta objektglaset tills halokarbonoljan täcker hela embryots yta.
4. Antikroppsinjektion och avbildning
- Förbered några injektionsglasnålar med hjälp av en mikropipettutdragare (se materialtabell för parameterinställningar) och ladda varje nål med 5 μL AlexaFluor-märkt antikroppslösning (från steg 1.6).
- Placera ett 25 mm x 25 mm täckglas ovanpå en glasskiva. Pipettera över 40 μl halokarbonolja och sprid ut den längs kanten på täckglaset.
- Under injektionsskopet, rikta in nålspetsen mot kanten på täckglaset under olja. Justera pikopumpens insprutningslufttryck (se materialtabell) så att en pump genererar en bubbla fylld med antikroppar. Bubbeldiametern bör begränsas till 20-50 μm (Figur 2F).
- Byt ut den tomma glasskivan mot en som innehåller embryon under olja. Rikta in injektionsnålens spets vinkelrätt mot embryonas främre och bakre axel (figur 2D,G).
- Kontrollera embryonas stadium för att säkerställa att de flesta har påbörjat cellularisering men ännu inte har påbörjat gastrulation (stadium 4 och stadium 5), utan kvarstår som syncytium (Figur 2F,G).
OBS: Kännetecknet för detta stadium är frånvaron av några spår eller veck och närvaron av en ovalformad, mörkfärgad gulesäck som är synlig i mitten av embryot. Morfologisk karakterisering av embryostadiet under olja baseras på bokkapitlet "Stages of Drosophila Embryogenesis" av Volker Hartenstein17. - Använd X-Y-stegmanipulatorn för att flytta embryon mot nålen tills spetsen kommer till mitten av äggulan. Pumpa två till tre gånger för att injicera antikroppar i äggulan. Lyckad injektion indikeras av att vitellinmembranrynkan snabbt försvinner när embryon får volym från antikroppslösningen (Figur 2G).
- Använd X-Y-stegmanipulatorn för att flytta embryon bort från nålen efter injektion och flytta nedåt till nästa embryo. Upprepa steg 6 tills alla embryon på objektglaset har injicerats.
- Överför glasglaset med injicerade embryon till en fuktkammare (Figur 2A-8). Inkubera vid 25 °C tills önskat stadium av embryoutvecklingen har uppnåtts.
- Lyft av 24 mm x 50 mm täckglaset från glasglaset och placera det direkt i glashållaren på mikroskopet. Den sida som inte har embryon kommer att stå inför målen. Lokalisera embryona med hjälp av en lins med låg förstoring under starkt fältljus och byt till en 40x eller 63x lins för högupplöst fluorescerande levande avbildning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att demonstrera fördelarna med antikroppsinjektionsmetoden jämfört med fluorescerande taggbaserad levande avbildning eller immunofluorescens, tillhandahålls två fallstudier som karakteriserar den dynamiska lokaliseringen av en transmembranreceptor med låg förekomst, Notch, och en typ av posttranslationell modifiering som kallas tyrosinfosforylering i levande embryon.
Notch-signalaktivitet spelar en viktig roll i cellödesbestämning under embryogenes och homeostas hos vuxna organ18,19. Vid aktivering av dess ligander Delta/Jagged20, klyvs den intracellulära domänen av transmembranreceptorn Notch och släpps ut i kärnan21, vilket initierar nedströms transkriptionsprogram för att driva cellödesförändringar22. Den statiska lokaliseringen av Notch-receptorn har karakteriserats väl av immunofluorescens i formaldehydfixerade vävnader. Den dynamiska lokaliseringen av Notch under ligandbindning eller den intracellulära klyvningsprocessen är dock fortfarande i stort sett okänd23, på grund av avsaknaden av en metod för att avbilda detta protein med relativt låg förekomst i hög hastighet på ett snabbt sätt. Här injicerade vi AlexaFluor-konjugerad GFP-nanobody i embryon som uttryckte GFP-märkt Notch från det endogena locus20. Utan injektion är Notch-GFP knappt detekterbart under vanliga live-bildförhållanden, och den fluorescerande signalen bleks snabbt under time-lapse-avbildning. Efter injektion förbättras signal-brusförhållandet för Notch-receptorn avsevärt, jämförbart med signalkvaliteten för immunofluorescens (Figur 3A). Dessutom möjliggör antikroppsinjektion temporal karakterisering av Notch-lokalisering med 45 sekunders intervall, utan en uppenbar förlust av signalintensitet under ett 5 minuters avbildningsfönster (Figur 3B).
Tyrosinfosforylering är en viktig typ av posttranslationell proteinmodifiering som förmedlar signaltransduktion i många biologiska vägar24. Högspecifika monoklonala antikroppar (såsom PY20 och 4G10) mot fosfotyrosin (p-Tyr) har utvecklats för att karakterisera lokalisering och nivåer av total tyrosinfosforylering med hjälp av immunofluorescens och western blots25. Även om inga fluorescerande taggar kan spåra fosforyleringsförändringar, måste vävnader eller celler fixeras och färgas eller lyseras och torkas vid olika tidpunkter för att ge ögonblicksbilder av fosforyleringsstatusen över tid, för att studera kinetiken för tyrosinfosforylering vid signalaktivering26 (t.ex. tillväxtfaktorbehandling). Tidsintervallet för detta tillvägagångssätt är minst några minuter långt och i sig felaktigt på grund av den varierande tid som krävs för procedurer som fixering eller celllys.
Här presenteras bevis för att antikroppsinjektionsmetoden möjliggör direkt visualisering av fosforyleringsstatus i levande embryon, genom att spåra lokalisering och intensitetsförändringar av tyrosinfosforylering med regelbundna tidsintervall på sekundnivå. AlexaFluor-konjugerad PY20-antikropp injicerades i embryon som uttryckte GFP-märkt myosinljuskedja och utförde tvåfärgad live-avbildning med 45 sekunders intervall. Som tidigare visats är tyrosinfosforylering starkt anrikad vid tricellulära övergångar27, ett mönster som också rekapituleras av immunofluorescens (Figur 4A). Intressant nog avslöjade live-avbildning också en ny, andra population av p-Tyr-signal under mitten av det apikala membranet, som inte observeras med immunofluorescens (Figur 4B). Genom tvåfärgsavbildning fann man att denna population av p-Tyr-signalen är i nära anslutning till medial myosin (Figur 4B, närbilder), en subpopulation av myosin28 som på liknande sätt endast uttalas under levande avbildningsförhållanden men knappt kan detekteras med hjälp av immunofluorescens. Dessutom uppvisar den mediala populationen av p-Tyr liknande pulserande koalescens- och avledningsmönster (Figur 4C), som tidigare visats för medial myosin28. Identiteten och funktionen hos en medial subpopulation av p-Tyr är fortfarande okänd. Sammantaget visar dessa resultat att antikroppsinjektionsmetoden i hög grad kan komplettera traditionella metoder för att karakterisera beteenden hos proteiner med låg förekomst och avslöja nya lokaliseringsmönster som kan ha störts under immunfluorescensprocessen.
Figur 1: Arbetsflöde för injektion av antikroppar. Schematiskt arbetsflöde som illustrerar de steg som ingår i antikroppsinjektionsmetoden. Hela processen, från embryoinsamling till antikroppsinjektion, tar vanligtvis cirka 4-5 timmar att slutföra. Efter injektion av antikroppar kan embryon inkuberas i en fuktighetskammare till önskat utvecklingsstadium före levande avbildning. AEL, efter äggläggning; RT, rumstemperatur; Ab, antikropp. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Embryoanpassning och injektion. A) Översikt över de föremål som krävs före injektionen, inklusive täckglas, glasglas, uttorkningslåda, pensel, pincett, cellsil, fuktkammare och agarosgel. (B) Riktade embryon fästa vid heptanlim i mitten av täckglaset och placerade ovanpå uttorkningspärlorna. C) Inriktning av embryonas främre och bakre axel parallellt med agarosgelens kant. (D) Översikt över injektionsinställningen. (E) Jämförelse av embryomorfologi före och efter uttorkningsprocessen, med fokus på rynkan i vitellinmembranet efter uttorkning. (F) Injektionsbubblans storlek efter ett enda tryck på pikopumpen. (G) Jämförelse av embryomorfologi före och efter antikroppsinjektion, med betoning på att membranrynkor försvinner efter injektion. (E-G) fångades under en objektivlins med 10x förstoring med hjälp av ljusfältsmikroskopi. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Levande avbildning av Notch-receptorn i tidiga embryon. (A) Lokalisering av endogent GFP-märkt Notch-receptor genom immunofluorescens (vänster), direkt live-avbildning baserad på GFP-autofluorescens (mitten) och AlexaFluor 594-konjugerad GFP-nanoinjektion (höger). (B) Dynamisk lokalisering av Notch-GFP avbildad med 45 sekunders intervall efter antikroppsinjektion. Alla bilder togs med embryots främre del till vänster och den ventrala sidan nedåt. Skalstreck = 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Avbildning i realtid av embryonala fosfotyrosinmönster. (A) Lokalisering av fosforylerat tyrosin (p-Tyr) i fixerade embryon genom immunofluorescens. (B) Lokalisering av p-Tyr (magenta) i levande embryon som uttrycker GFP-märkt myosinljuskedja (grön). Den vita streckade rutan visar närbilder av den mediala populationen av fosfotyrosin och myosin under det apikala membranet. Skalstreck = 10 μm. (C) Lokalisering av p-Tyr och GFP-myosin avbildad var 45:e sekund i levande embryon. Vita pilar indikerar den mediala populationen av p-Tyr och myosin. Alla bilder togs med embryonas främre del till vänster och den ventrala sidan nedåt. Skalstreck = 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna presenterade procedur beskriver den specialiserade metoden för fluorescensmärkning med anpassade antikroppar och efterföljande injektion i tidiga stadier av Drosophila-embryon . Denna teknik underlättar visualisering i realtid av proteiner eller posttranslationella modifieringar som finns i små mängder och som vanligtvis är svåra att observera genom konventionella GFP/mCherry-märkningsmetoder.
Försiktighet bör iakttas när denna metod utvidgas till att omfatta kvantitativa jämförelser mellan vildtypsembryon och muterade embryon. Även om koncentrationen av primära och sekundära antikroppar kan hållas densamma mellan kontroll- och experimentgrupper vid immunofluorescens, kan mängden antikroppar som injiceras och märkningseffektiviteten variera mellan embryon. Därför bör kvantitativ analys begränsas till att spåra fluorescerande intensitetsförändringar över tid eller utföra korrelationsanalys med signaler från andra kanaler i samma embryo när man utför flerfärgsavbildning av levande organismer. Till exempel kan samlokalisering och korrelationsanalys utföras med hjälp av p-Tyr- och myosinintensiteter27, medan p-Tyr-intensiteter inte kan jämföras direkt mellan vildtyps- och gen-X-knockdown-embryon med hjälp av antikroppsinjektionsmetoden.
I likhet med andra metoder baserade på fluorescerande taggar för att undersöka proteindynamik kan antikroppsbindning potentiellt förändra aktiviteten, trafiken eller lokaliseringen av målproteiner. Därför är monoklonala antikroppar eller nanokroppar att föredra framför polyklonala antikroppar för injektion. Eftersom epitoperna hos monoklonala antikroppar eller nanokroppar är väldefinierade, kan man modellera om blockering av dessa epitoper med antikroppar förändrar proteinaktiviteten baserat på alfa-veckningsstrukturer 12,25. Å andra sidan är epitoper av polyklonala antikroppar inte exakt avgränsade, och deras bindning kan potentiellt förändra proteinlokalisering eller aktivitet om katalytiska fickor eller signalpeptider av målproteiner blockeras. För det andra kan antikroppar känna igen andra icke-specifika epitoper än målproteiner, särskilt med tanke på att det inte finns några "washout"-steg här, som i immunofluorescens, för att ta bort icke-specifika bindningar med lägre affinitet. Därför är det viktigt att ha kontrollgrupper, som att injicera antikroppar i celler som saknar epitopen, för att verifiera om den observerade signalen verkligen återspeglar målproteinerna eller andra ospecifika epitoper.
Injektion av antikroppar skiljer sig inte från att injicera siRNA eller CRISPR gRNA när det gäller experimentell uppställning. Därför bör de flesta cellulära system som är mottagliga för injektioner vara kompatibla med antikroppsinjektionsmetoden. I Drosophila-embryon är Alexa Fluor-konjugerade antikroppar stabila under utvecklingen, och fluorescerande signaler förblir detekterbara efter timmar av embryogenes. För andra system, t.ex. Xenopus- eller zebrafiskembryon, bör koncentrationen och injektionsvolymen av antikroppar testas empiriskt genom seriespädningar för att uppnå idealisk märkningseffektivitet. Dessutom kan alternativa fluorescerande färgämnen som ATTO10 potentiellt erbjuda ett bättre signal-brusförhållande och vattenlöslighet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att redovisa.
Acknowledgments
Vi vill tacka Dr. Jennifer A. Zallen för att ha tillhandahållit Sqh-GFP Drosophila-linjen och stöd för den initiala utvecklingen av denna teknik, och Dr. Francois Schweisguth för att ha tillhandahållit Notch-GFP Drosophila-linjen . Detta arbete stöddes av finansiering från National Natural Science Foundation of China (32270809) till H.H.Yu, generöst ekonomiskt och personalstöd från School of Life Sciences, SUSTech, och finansiering till Y. Yan från Shenzhen Science and Technology Innovation Commission/JCYJ20200109140201722.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sangon Biotech | A620014 | |
| Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit | Invitrogen | A20185 | Purification column from step 1.6 is included in this kit |
| Biological Microscope | SOPTOP | EX20 | Eyepiece lens: PL 10X/20. Objective lens: 10x/0.25 |
| Bleach | Clorox® | ||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5245 | |
| Cell Strainer | FALCON | 352350 | |
| Desiccation chamber | LOCK&LOCK | HSM8200 | 320ml |
| Dissecting Microscope | Mshot | MZ62 | Eyepiece lens: WF10X/22mm. |
| Double-sided Tape | Scotch | 665 | |
| Fine Super Tweezer | VETUS | ST-14 | |
| Fisherbrand™ Cover Glasses: Rectangles | Fisherbrand | 12-545F | |
| Fisherbrand™ Superfrost™ Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Forcep | VETUS | 33A-SA | |
| Halocarbon oil 27 | Sigma-Aldrich | H8773-100ML | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898-100ML | |
| Heptane | Sigma-Aldrich | H2198-1L | Heptane glue is made of double-sided tape immersed in heptane |
| Dehydration reagent | TOKAI | 1-7315-01 | Fill to 90% volume of the dessication chamber |
| Manual Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
| Micropipette puller | World Precision Instruments | PUL-1000 | Procedure: step 1, Heat: 290, Force:300, Distance:1.00, Delay:50. Step 2, Heat: 290, Force:300, Distance:2.21, Delay:50 |
| Pneumatic picopump | World Precision Instruments | PV 830 | Eject: 20 psi; Range: 100ms; Duration: timed |
| PY20 | Santa Cruz | SC-508 | |
| Square petri dishes | Biosharp | BS-100-SD | |
| GFP nanobody | Chromotek | gt |
References
- Coons, A. H.
- Arthur, G., et al.
- Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H.
- Ragkousi, K., Gibson, M. C. Epithelial integrity and cell division: Concerted cell cycle control. Cell Cycle. 17 (4), 399-400 (2018).
- Herszterg, S., Leibfried, A., Bosveld, F., Martin, C., Bellaiche, Y. Interplay between the dividing cell and its neighbors regulates adherens junction formation during cytokinesis in epithelial tissue. Developmental Cell. 24 (3), 256-270 (2013).
- Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, aequorea. Journal of Cellular and Comparative Physiology. 59 (3), 223-239 (1962).
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
- Boshart, M., et al. A very strong enhancer is located upstream of an immediate early gene of human cytomegalovirus. Cell. 41 (2), 521-530 (1985).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Rodriguez, E. A., et al. The growing and glowing toolbox of fluorescent and photoactive proteins. Trends in Biochemical Sciences. 42 (2), 111-129 (2016).
- Berg, E. A., Fishman, J. B. Labeling antibodies using N -Hydroxysuccinimide (NHS)-fluorescein. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (3), (2019).
- Saerens, D., et al. Identification of a universal VHH framework to graft non-canonical antigen-binding loops of camel single-domain antibodies. Journal of Molecular Biology. 352 (3), 597-607 (2005).
- Loncar, D., Singer, S. J. Cell membrane formation during the cellularization of the syncytial blastoderm of Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (6), 2199-2203 (1995).
- Lye, C. M., Naylor, H. W., Sanson, B. Subcellular localisations of the CPTI collection of YFP-tagged proteins in Drosophila embryos. Development. 141 (20), 4006-4017 (2014).
- Iordanou, E., Chandran, R. R., Blackstone, N., Jiang, L. RNAi interference by dsRNA injection into Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. 50, e2477 (2011).
- Figard, L., Sokac, A. M. Imaging cell shape change in living Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. 49, e2503 (2011).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. The embryonic development of Drosophila melanogaster. , 9-102 (1997).
- Ho, D. M., Artavanis-Tsakonas, S.
- Kopan, R., Ilagan,, Ma, X. G. The canonical Notch signaling pathway: unfolding the activation mechanism. Cell. 137 (2), 216-233 (2009).
- Fehon, R. G., et al. Molecular interactions between the protein products of the neurogenic loci Notch and Delta, two EGF-homologous genes in Drosophila. Cell. 61 (3), 523-534 (1990).
- Struhl, G., Greenwald, I. Presenilin is required for activity and nuclear access of Notch in Drosophila. Nature. 398 (6727), 522-525 (1999).
- Henrique, D., Schweisguth, F. Mechanisms of Notch signaling: a simple logic deployed in time and space. Development. 146 (3), dev172148 (2019).
- Trylinski, M., Mazouni, K., Schweisguth, F. Intra-lineage fate decisions involve of notch receptors basal to the midbody in drosophila sensory organ precursor cells. Current Biology. 27 (15), 2239.e3-2247.e3 (2017).
- Hunter, T. Protein kinases and phosphatases: The Yin and Yang of protein phosphorylation and signaling. Cell. 80 (2), 225-236 (1995).
- Glenney, J. R., Zokas, L., Kamps, M. P.
- Hunter, T., Cooper, J. A. Epidermal growth factor induces rapid tyrosine phosphorylation of proteins in A431 human tumor cells. Cell. 24 (3), 741-752 (1981).
- Yu, H. H., Zallen, J. A. Abl and Canoe/Afadin mediate mechanotransduction at tricellular junctions. Science. 370 (6520), eaba5528 (2020).
- Martin, A. C., Kaschube, M., Wieschaus, E. F. Pulsed contractions of an actin–myosin network drive apical constriction. Nature. 457 (7228), 495-499 (2009).
