Summary
该协议描述了定制的基于抗体的荧光标记和注射到早期 果蝇 胚胎中，以实现使用传统GFP / mCherry标签方法难以检测的低丰度蛋白质或翻译后修饰的实时成像。
Abstract
使用 GFP（绿色荧光蛋白）和其他荧光标签对活细胞中的蛋白质进行可视化，极大地提高了对蛋白质定位、动力学和功能的理解。与免疫荧光相比，实时成像更准确地反映了蛋白质的定位，而不会因组织固定而产生潜在的伪影。重要的是，实时成像能够对蛋白质水平和定位进行定量和时间表征，这对于理解细胞运动或分裂等动态生物过程至关重要。然而，荧光标记方法的一个主要局限性是需要足够高的蛋白质表达水平才能实现成功的可视化。因此，无法检测到许多表达水平相对较低的内源性标记荧光蛋白。另一方面，使用病毒启动子的异位表达有时会导致蛋白质错定位或生理环境中的功能改变。为了解决这些局限性，提出了一种在活胚胎中利用高灵敏度抗体介导的蛋白质检测的方法，基本上无需组织固定即可进行免疫荧光。作为原理证明，在活胚胎中几乎无法检测到的内源性 GFP 标记的 Notch 受体在抗体注射后可以成功可视化。此外，这种方法适用于可视化活胚胎中的翻译后修饰 （PTM），允许检测早期胚胎发生过程中酪氨酸磷酸化模式的时间变化，并揭示顶膜下磷酸酪氨酸 （p-Tyr） 的新亚群。这种方法可以修改以适应其他蛋白质特异性、标签特异性或 PTM 特异性抗体，并且应该与其他适合注射的模式生物或细胞系兼容。该协议为低丰度蛋白质或PTM的实时成像开辟了新的可能性，而这些蛋白质或PTM以前很难使用传统的荧光标记方法进行检测。
Introduction
免疫荧光是现代细胞生物学的一项基石技术，最初由 Albert Coons 开发，它能够检测其天然细胞区室的分子并表征亚细胞器或机器的分子组成1。结合基因操作，免疫荧光有助于建立现在广为接受的概念，即蛋白质定位对其功能至关重要2。除了特异性一抗和明亮的荧光染料外，该技术的成功还依赖于称为固定和透化的初步过程，该过程保留了细胞形态，固定了抗原，并增加了抗体进入细胞内区室的可及性。不可避免地，固定和透化过程会杀死细胞并终止所有生物过程3.因此，免疫荧光仅提供蛋白质生命旅程的快照。然而，许多生物过程（如细胞迁移和分裂）本质上是动态的，需要以时空分辨的方式研究蛋白质行为4,5。
为了研究生物体中的蛋白质动力学，已经开发了基于基因编码荧光蛋白（如绿色荧光蛋白 （GFP）6 和高速共聚焦显微镜）的实时成像方法。简而言之，目标蛋白可以通过基因操作与GFP7融合，然后从病毒或酵母启动子（如巨细胞病毒（CMV）8 或上游激活序列（UAS）9）异位表达。由于GFP本质上是自发荧光的，因此不需要荧光团偶联抗体来揭示靶蛋白的定位，从而绕过了固定或透化的初步过程的必要性。在过去的二十年中，已经开发了跨越整个波长光谱的荧光标签10，可以同时对多种靶蛋白进行多色实时成像。然而，与化学工程荧光染料（如AlexaFluor或ATTO）相比，这些基因编码的荧光蛋白的自发荧光在内源性启动子表达时相对较弱且不稳定，特别是在较长时间尺度的实时成像期间10。虽然这种不足可以通过过度表达荧光标记的靶蛋白来缓解，但许多具有酶活性的蛋白（如激酶和磷酸酶）如果不在生理水平上表达，会严重破坏正常的生物过程。
该协议提出了一种在实时图像设置中实现基于光稳定抗体的靶标照明的方法，基本上允许免疫荧光，而无需固定或透化过程（图1）。通过简单的基于 NHS 的伯胺反应11，可以将荧光染料（如 AlexaFluor 488 或 594）与基本上任何一抗或 GFP/HA/Myc 纳米抗体12 偶联。利用所有 果蝇 胚胎细胞在第 13 阶段共享共同细胞质的发育特征，可以在注射染料偶联抗体后实现整个胚胎的抗原结合和照明。随着 果蝇 和其他模型系统14中可用的内源性标记蛋白库的扩展，该方法可以通过揭示活组织中低丰度荧光标记蛋白和其他非荧光标记（HA/Myc标记）蛋白的动力学来潜在地扩大这些文库的应用。
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Protocol
实验是按照南方科技大学生命科学学院的指导和批准进行的。使用的生物体是黑腹果蝇，基因型是Notch-Knockin-GFP（X染色体）和Sqh-sqh-GFP（染色体II），分别由Francois Schweisguth博士（巴斯德研究所）和Jennifer Zallen博士（斯隆凯特琳研究所）的实验室慷慨提供。虽然该协议主要侧重于抗体标记和实时成像方面，但有关果蝇胚胎收集和注射的更详细描述，请参阅已发表的报告15,16。
1. 抗体的荧光标记
- 优选地，使用单克隆抗体或纳米抗体来获取目标蛋白。制备 1 mg/mL 或更高的抗体储备浓度。
注：在本研究中，以GFP纳米抗体（见 材料表）为例。市售的GFP纳米抗体的包装浓度为1.0 mg/mL，体积为250 μL。 此外，还利用了市售的抗体标记试剂盒（参见 材料表），该试剂盒通过琥珀酰亚胺酯反应将 Alexa Fluor 594 偶联到蛋白质的伯胺上11。重要的是，这种标记过程不会显著改变抗体浓度。 - 通过将组分 B（在抗体标记试剂盒中提供）重悬于 1 mL 去离子水中来制备 1 M 碳酸氢钠溶液。
- 将抗体浓度调节至1.0 mg/mL，然后加入1/10体积（ 100μL GFP纳米抗体为10μL）的1M碳酸氢钠溶液。
- 将 110 μL 抗体混合物（来自步骤 1.3）直接加入含有 Alexa Fluor 594 染料的试管中。倒置混合（不要涡旋）并在室温下在旋转器上孵育1小时。
- 从偶联试剂盒中组装纯化柱（参见 材料表）。准备一个 1.5 mL 树脂床（在抗体标记试剂盒中提供），并在室温 （RT） 下以 1100 x g 离心色谱柱 3 分钟，以除去树脂中多余的液体。
- 将反应混合物（从步骤1.4开始）滴加到树脂柱的顶部，并在4°C下以1100× g 离心5分钟以收集标记的抗体。收集的抗体应呈粉红色，体积应略小于100μL。 储存在4°C的铝箔包裹或深色管中。
2. 果蝇 胚胎的制备
- 将 200 只新孵化的成年 果蝇 放入塑料圆柱形笼子（直径 = 5 厘米，高度 = 8 厘米）中，雄性与雌性的比例为 1：10。用多孔金属网密封一侧用于通风，另一侧用果汁/酵母糊琼脂平板密封。
- 在胚胎收集前三天，每 12 小时更换一次平板。这样可以同步 果蝇 产卵并提高采集效率。
- 在注射当天，将笼子换成含有最少酵母糊的果汁盘子，并在25°C下收集胚胎1小时。如果第一轮收集没有产生足够的胚胎（<50个胚胎），则丢弃第一块板并重复此步骤进行第二轮收集，直到在1小时内产下超过100个胚胎。
- 从笼子中取出板以停止产卵，并在25°C下再孵育2小时，以获得2-3小时的胚胎。胚胎的正确阶段对于抗体注射的成功至关重要。
- 要去除胚胎的蛋壳，请在果汁盘中加入2mL 50%漂白剂，然后用画笔轻轻地将胚胎从盘子中取出（图2A-4）。通常，胚胎将直接放在酵母糊的顶部。在这种情况下，可以将酵母糊刷入漂白剂溶液中以收集所有胚胎。
- 将漂浮的胚胎在50%漂白剂中孵育2分钟，并每30秒旋转一次果汁盘，以提高蛋壳去除效率。
- 将胚胎/漂白剂混合物倒入70μm尼龙细胞过滤器中转移（图2A-7）。用水瓶彻底清洗胚胎，以去除任何残留的漂白剂和酵母膏。用纸巾完全擦干细胞过滤器，确保去除胚胎周围的多余水分。
3. 胚胎对齐和干燥
- 制备5cm x 5cm x 0.5cm（宽，长，高）4%琼脂糖凝胶（图2A-9），并让凝胶冷却至室温。使用干净的剃须刀片切割1cm x 3cm x 0.5cm（宽，长，高）琼脂糖块，并将块放在载玻片上（图2A-2）。在解剖镜下检查凝胶块，确保边缘切直，表面平整干燥。
- 使用画笔将胚胎从过滤器转移到凝胶块上。轻轻刷洗，将胚胎沿块的中线均匀地铺开。理想情况下，胚胎簇被分成单个胚胎或双峰，而不会相互接触。
- 准备一个镊子，两条腿紧紧地粘在一起，形成一个细尖（图2A-5）。在解剖镜下，使用镊子拾取单个胚胎，并将它们沿着凝胶块的长边缘放置。对齐20-30个胚胎，确保其前后轴平行于边缘（图2C）。
- 在24mm×50mm盖玻片（图2A-1）的中心移液10μL庚烷胶（参见材料表），并使用移液器吸头将胶水铺入0.5cm x 3 cm矩形区域。等待胶水完全干燥后再使用。
- 将载玻片和凝胶块放在桌子的边缘，胚胎朝外。使用平头镊子（图2A-6）用胶水提起盖玻片，并将其保持在胚胎顶部，胶水面以约45度的倾斜角度朝向胚胎。
注意：轻轻地将盖玻片压在凝胶块上，使胚胎与胶水接触，然后快速释放压力并提起盖玻片。施加的张力至关重要，这样胚胎才能稳定地附着在胶水上，而不会被压得太紧而爆裂。 - 将10μL水移液到新载玻片的中心，并将胚胎放在盖玻片上，胚胎的一面朝上（图2B）。确保使用水代替指甲油或其他粘合剂将盖玻片固定在载玻片上，因为盖玻片的这一侧将直接放置在共聚焦透镜的顶部以进行实时成像。
- 将胚胎在干燥室（图2A-3）（见材料表）中干燥10-15分钟，直到卵黄膜起皱（图2E）。所需时间可能因房间湿度而异，应针对每种实验室条件进行实验测试。
- 在胚条的一端移液40μL卤代烃油（27型和700型的混合物，体积比例为1：1，参见 材料表）。倾斜载玻片，直到卤代烃油覆盖胚胎的整个表面。
4. 抗体注射和成像
- 使用微量移液器拉拔器准备一些注射玻璃针（参数设置见 材料表 ），并向每个针头加载 5 μL AlexaFluor 标记的抗体溶液（来自步骤 1.6）。
- 将 25 mm x 25 mm 的盖玻片放在载玻片的顶部。移液 40 μL 卤代烃油，并沿盖玻片边缘铺开。
- 在注射镜下，在油下将针尖对准盖玻片的边缘。调整皮泵的注射气压（见 材料表），使一个泵产生一个充满抗体的气泡。气泡直径应限制在20-50μm（图2F）。
- 用含有油下胚胎的载玻片替换空载玻片。将注射针尖垂直对准胚胎的前后轴（图2D，G）。
- 检查胚胎的阶段，以确保大多数胚胎已经开始细胞化但尚未开始原肠胚形成（第4阶段和第5阶段），保留为合胞体（图2F，G）。
注意：这个阶段的标志是没有任何凹槽或褶皱，并且在胚胎中心可见椭圆形的深色卵黄囊。油下胚胎阶段的形态学特征基于VolkerHartenstein 17的“果蝇胚胎发生阶段”一章。 - 使用 X-Y 阶段操纵器将胚胎移向针头，直到尖端到达蛋黄的中心。泵送两到三次，将抗体注射到蛋黄中。当胚胎从抗体溶液中增加体积时，卵黄膜皱纹迅速消失，表明注射成功（图2G）。
- 使用X-Y阶段操纵器在注射后将胚胎从针头上移开，并向下移动到下一个胚胎。重复步骤6，直到注射载玻片上的所有胚胎。
- 将注射胚胎的载玻片转移到湿度室（图2A-8）。在25°C下孵育，直到达到所需的胚胎发育阶段。
- 将 24 mm x 50 mm 盖玻片从载玻片上取下，并将其直接放入显微镜的载玻片支架中。没有胚胎的一方将面临目标。在明场照明下使用低倍率镜头定位胚胎，并切换到 40 倍或 63 倍镜头进行高分辨率荧光实时成像。
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Representative Results
为了证明抗体注射方法相对于基于荧光标签的实时成像或免疫荧光的优势，提供了两个案例研究，以表征低丰度跨膜受体Notch的动态定位，以及一种称为酪氨酸磷酸化的翻译后修饰在活胚胎中。
Notch信号转导活性在胚胎发生和成体器官稳态过程中的细胞命运决定中起主要作用18,19。在被其配体 Delta/Jagged20 激活后，跨膜受体 Notch 的细胞内结构域被切割并释放到细胞核21 中，启动下游转录程序以驱动细胞命运变化22。Notch受体的静态定位已通过甲醛固定组织中的免疫荧光得到很好的表征。然而，Notch在配体结合或细胞内切割过程中的动态定位在很大程度上仍然是未知的23，因为缺乏以高速方式对这种相对低丰度的蛋白质进行实时成像的方法。在这里，我们将 AlexaFluor 偶联的 GFP 纳米抗体注射到表达内源性基因座 20 的 GFP 标记 Notch 的胚胎中。在没有注射的情况下，Notch-GFP在标准的实时成像条件下几乎无法检测到，并且荧光信号在延时成像过程中会迅速漂白。注射后，Notch受体的信噪比显着改善，与免疫荧光的信号质量相当（图3A）。此外，抗体注射允许以 45 秒的间隔对 Notch 定位进行时间表征，在 5 分钟的成像窗口内不会出现明显的信号强度损失（图 3B）。
酪氨酸磷酸化是一种主要类型的翻译后蛋白质修饰，可介导许多生物途径中的信号转导24。已经开发了针对磷酸酪氨酸 （p-Tyr） 的高度特异性单克隆抗体（如 PY20 和 4G10），以使用免疫荧光和蛋白质印迹25 表征整体酪氨酸磷酸化的定位和水平。虽然没有荧光标签可以跟踪磷酸化变化，但需要在不同的时间点对组织或细胞进行固定和染色或裂解和印迹，以提供磷酸化状态随时间变化的快照，以研究信号激活时酪氨酸磷酸化的动力学26 （例如，生长因子处理）。这种方法的时间间隔至少为几分钟，并且由于固定或细胞裂解等程序所需的时间可变，因此本质上是不准确的。
在这里，有证据表明抗体注射方法可以直接可视化活胚胎中的磷酸化状态，以规律的秒级时间间隔跟踪酪氨酸磷酸化的定位和强度变化。将AlexaFluor偶联的PY20抗体注射到表达GFP标记肌球蛋白轻链的胚胎中，并以45 s的间隔进行双色实时成像。如前所述，酪氨酸磷酸化在三细胞连接处高度富集27，这种模式也被免疫荧光概括（图 4A）。有趣的是，实时成像还揭示了顶膜中心下方的第二个新的p-Tyr信号群，这是使用免疫荧光无法观察到的（图4B）。通过双色成像，发现这种p-Tyr信号群与内侧肌球蛋白（图4B，特写）非常接近，这是肌球蛋白28 的一个亚群，同样仅在实时成像条件下明显，但使用免疫荧光几乎无法检测到。此外，p-Tyr的内侧群体表现出相似的脉动聚结和耗散模式（图4C），如先前所示的内侧肌球蛋白28。p-Tyr 内侧亚群的身份和功能仍然未知。总之，这些结果表明，抗体注射方法可以极大地补充传统方法，以表征低丰度蛋白质的行为，并揭示在免疫荧光过程中可能被破坏的新定位模式。
图 1：抗体注射工作流程。 工作流程示意图说明了抗体注射方法中涉及的步骤。从胚胎采集到抗体注射的整个过程通常需要大约 4-5 小时才能完成。注射抗体后，胚胎可以在湿度室中孵育至所需的发育阶段，然后再进行活体成像。AEL，产卵后;RT， 室温;Ab， 抗体。 请点击这里查看此图的较大版本.
图2：胚胎比对和注射。 （A） 注射前所需物品概述，包括盖玻片、载玻片、干燥盒、画笔、镊子、细胞过滤器、湿度室和琼脂糖凝胶。（B）将对齐的胚胎附着在盖玻片中心的庚烷胶上，并放置在干燥珠的顶部。（C）胚胎的前后轴平行于琼脂糖凝胶的边缘排列。（D） 注射装置概述。（E）干燥过程前后胚胎形态的比较，重点是干燥后卵黄膜的皱纹。（F） 单次按压微泵后注射气泡的大小。（G）抗体注射前后胚胎形态的比较，突出注射后膜皱纹的消失。（E-G）使用明场显微镜在10倍放大倍率物镜下捕获。请点击这里查看此图的较大版本.
图3：早期胚胎中Notch受体的实时成像。 （A） 通过免疫荧光（左）、基于 GFP 自发荧光的直接实时成像（中）和 AlexaFluor 594 偶联的 GFP 纳米抗体注射（右）定位内源性 GFP 标记的 Notch 受体。（B） 抗体注射后以 45 秒间隔成像的 Notch-GFP 的动态定位。所有图像都是在胚胎前部左侧和腹侧朝下的情况下获得的。比例尺 = 10 μm。 请点击这里查看此图的较大版本.
图4：胚胎磷酸酪氨酸模式的实时成像。 （A）通过免疫荧光在固定胚胎中定位磷酸化酪氨酸（p-Tyr）。（B） p-Tyr（品红色）在表达GFP标记的肌球蛋白轻链（绿色）的活胚胎中的定位。白色虚线框表示顶膜下磷酸酪氨酸和肌球蛋白内侧群体的特写视图。比例尺 = 10 μm。 （C） 每 45 秒在活胚胎中成像一次 p-Tyr 和 GFP-肌球蛋白的定位。白色箭头表示 p-Tyr 和肌球蛋白的内侧群体。所有图像都是在胚胎前部左侧和腹侧朝下的情况下拍摄的。比例尺 = 10 μm。 请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
该介绍的程序概述了使用定制抗体进行荧光标记并随后注射到早期 果蝇 胚胎中的专用方法。该技术有助于实时可视化少量存在的蛋白质或翻译后修饰，这些蛋白质或翻译后修饰通常难以通过传统的GFP/mCherry标记方法观察到。
在扩展该方法以在野生型和突变型胚胎之间进行定量比较时应谨慎行事。虽然在免疫荧光中，对照组和实验组之间的一抗和二抗浓度可以保持相同，但注射的抗体量和标记效率可能因胚胎而异。因此，在进行多色实时成像时，定量分析应仅限于跟踪荧光强度随时间的变化或与同一胚胎中其他通道的信号进行相关性分析。例如，可以使用p-Tyr和肌球蛋白强度27进行共定位和相关性分析，而使用抗体注射方法不能直接比较野生型和基因X敲低胚胎之间的p-Tyr强度。
与其他基于荧光标签的蛋白质动力学检查方法类似，抗体结合可能会改变靶蛋白的活性、运输或定位。因此，注射用单克隆抗体或纳米抗体优于多克隆抗体。由于单克隆抗体或纳米抗体的表位定义明确，因此用抗体阻断这些表位是否会改变蛋白质活性可以基于α折叠结构进行建模12,25。另一方面，多克隆抗体的表位没有被精确描述，如果靶蛋白的催化口袋或信号肽被阻断，它们的结合可能会改变蛋白质的定位或活性。其次，抗体可以识别靶蛋白以外的非特异性表位，特别是考虑到这里没有像免疫荧光那样的“清除”步骤来去除低亲和力的非特异性结合。因此，重要的是要有对照组，例如将抗体注射到缺乏表位的细胞中，以验证观察到的信号是否真正反映了靶蛋白或其他非特异性表位。
就实验设置而言，注射抗体与注射 siRNA 或 CRISPR gRNA 没有什么不同。因此，大多数适合注射的细胞系统应该与抗体注射方法兼容。在 果蝇 胚胎中，Alexa荧光偶联抗体在发育过程中是稳定的，并且在胚胎发生数小时后仍可检测到荧光信号。对于非洲爪蟾或斑马鱼胚胎等其他系统，应通过连续稀释液对抗体的浓度和进样体积进行经验性测试，以达到理想的标记效率。此外，替代荧光染料（如ATTO10 ）可能提供更好的信噪比和水溶性。
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Disclosures
作者没有利益冲突需要声明。
Acknowledgments
我们要感谢 Jennifer A. Zallen 博士提供 Sqh-GFP 果蝇 品系并为该技术的初始开发提供支持，并感谢 Francois Schweisguth 博士提供 Notch-GFP 果蝇 品系。这项工作得到了中国国家自然科学基金（32270809）对H.H.Yu的资助，南方科技大学生命科学学院的慷慨资助和人员支持，以及深圳市科学技术创新委员会/JCYJ20200109140201722对Y. Yan的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sangon Biotech | A620014 | |
| Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit | Invitrogen | A20185 | Purification column from step 1.6 is included in this kit |
| Biological Microscope | SOPTOP | EX20 | Eyepiece lens: PL 10X/20. Objective lens: 10x/0.25 |
| Bleach | Clorox® | ||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5245 | |
| Cell Strainer | FALCON | 352350 | |
| Desiccation chamber | LOCK&LOCK | HSM8200 | 320ml |
| Dissecting Microscope | Mshot | MZ62 | Eyepiece lens: WF10X/22mm. |
| Double-sided Tape | Scotch | 665 | |
| Fine Super Tweezer | VETUS | ST-14 | |
| Fisherbrand™ Cover Glasses: Rectangles | Fisherbrand | 12-545F | |
| Fisherbrand™ Superfrost™ Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Forcep | VETUS | 33A-SA | |
| Halocarbon oil 27 | Sigma-Aldrich | H8773-100ML | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898-100ML | |
| Heptane | Sigma-Aldrich | H2198-1L | Heptane glue is made of double-sided tape immersed in heptane |
| Dehydration reagent | TOKAI | 1-7315-01 | Fill to 90% volume of the dessication chamber |
| Manual Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
| Micropipette puller | World Precision Instruments | PUL-1000 | Procedure: step 1, Heat: 290, Force:300, Distance:1.00, Delay:50. Step 2, Heat: 290, Force:300, Distance:2.21, Delay:50 |
| Pneumatic picopump | World Precision Instruments | PV 830 | Eject: 20 psi; Range: 100ms; Duration: timed |
| PY20 | Santa Cruz | SC-508 | |
| Square petri dishes | Biosharp | BS-100-SD | |
| GFP nanobody | Chromotek | gt |
References
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