Summary
Dieses Protokoll beschreibt die maßgeschneiderte antikörperbasierte Fluoreszenzmarkierung und Injektion in frühe Drosophila-Embryonen , um Live-Imaging von Proteinen mit geringer Häufigkeit oder posttranslationalen Modifikationen zu ermöglichen, die mit herkömmlichen GFP/mCherry-Tag-Ansätzen nur schwer zu erkennen sind.
Abstract
Die Visualisierung von Proteinen in lebenden Zellen mit GFP (Green Fluorescent Protein) und anderen fluoreszierenden Markierungen hat das Verständnis der Lokalisierung, Dynamik und Funktion von Proteinen erheblich verbessert. Im Vergleich zur Immunfluoreszenz spiegelt die Live-Bildgebung die Proteinlokalisierung genauer wider, ohne dass potenzielle Artefakte durch die Gewebefixierung entstehen. Wichtig ist, dass die Live-Bildgebung eine quantitative und zeitliche Charakterisierung von Proteinspiegeln und -lokalisierungen ermöglicht, was für das Verständnis dynamischer biologischer Prozesse wie Zellbewegung oder -teilung entscheidend ist. Eine wesentliche Einschränkung von Fluoreszenz-Markierungsansätzen ist jedoch die Notwendigkeit einer ausreichend hohen Proteinexpression, um eine erfolgreiche Visualisierung zu erreichen. Folglich können viele endogen markierte fluoreszierende Proteine mit relativ geringer Expression nicht nachgewiesen werden. Auf der anderen Seite kann die ektopische Expression mit viralen Promotoren manchmal zu Proteinfehllokalisationen oder funktionellen Veränderungen in physiologischen Kontexten führen. Um diese Einschränkungen zu adressieren, wird ein Ansatz vorgestellt, der einen hochempfindlichen Antikörper-vermittelten Proteinnachweis in lebenden Embryonen verwendet, der im Wesentlichen Immunfluoreszenz ohne Gewebefixierung durchführt. Als Proof of Principle kann ein endogen GFP-markierter Notch-Rezeptor, der in lebenden Embryonen kaum nachweisbar ist, nach Antikörperinjektion erfolgreich sichtbar gemacht werden. Darüber hinaus wurde dieser Ansatz angepasst, um posttranslationale Modifikationen (PTMs) in lebenden Embryonen sichtbar zu machen, was die Detektion zeitlicher Veränderungen der Tyrosinphosphorylierungsmuster während der frühen Embryogenese ermöglicht und eine neue Subpopulation von Phosphotyrosin (p-Tyr) unter apikalen Membranen aufdeckt. Dieser Ansatz kann modifiziert werden, um andere proteinspezifische, tagspezifische oder PTM-spezifische Antikörper aufzunehmen, und sollte mit anderen injektionsfähigen Modellorganismen oder Zelllinien kompatibel sein. Dieses Protokoll eröffnet neue Möglichkeiten für die Live-Bildgebung von Proteinen mit geringer Häufigkeit oder PTMs, die bisher mit herkömmlichen Fluoreszenz-Markierungsmethoden nur schwer zu erkennen waren.
Introduction
Die Immunfluoreszenz ist eine Grundtechnik der modernen Zellbiologie, die ursprünglich von Albert Coons entwickelt wurde und die Detektion von Molekülen in ihren nativen zellulären Kompartimenten und die Charakterisierung der molekularen Zusammensetzung von subzellulären Organellen oder Maschinen ermöglicht1. In Verbindung mit genetischen Manipulationen trägt die Immunfluoreszenz dazu bei, das heute allgemein akzeptierte Konzept zu etablieren, dass die Lokalisierung von Proteinen für ihre Funktion unerlässlich ist2. Abgesehen von spezifischen Primärantikörpern und hellen Fluoreszenzfarbstoffen beruht der Erfolg dieser Technik auf einem vorläufigen Prozess namens Fixierung und Permeabilisierung, der zelluläre Morphologien bewahrt, Antigene immobilisiert und die Zugänglichkeit von Antikörpern in intrazelluläre Kompartimente erhöht. Der Fixierungs- und Permeabilisierungsprozess würde unweigerlich Zellen abtöten und alle biologischen Prozesse beenden3. Daher liefert die Immunfluoreszenz nur Momentaufnahmen des Lebenswegs von Proteinen. Viele biologische Prozesse, wie z.B. Zellmigration und Zellteilungen, sind jedoch dynamischer Natur und erfordern eine räumlich-zeitlich aufgelöste Untersuchung des Verhaltens von Proteinen 4,5.
Um die Proteindynamik in lebenden Organismen zu untersuchen, wurden Live-Imaging-Methoden entwickelt, die auf genetisch kodierten fluoreszierenden Proteinen wie dem grün fluoreszierenden Protein (GFP)6 basieren, und konfokale Hochgeschwindigkeitsmikroskope. Kurz gesagt, das interessierende Protein kann genetisch so manipuliert werden, dass es mit GFP7 fusioniert wird, und dann ektopisch aus viralen oder Hefepromotoren wie dem Cytomegalievirus (CMV)8 oder der Upstream-Aktivierungssequenz (UAS)9 exprimiert werden. Da GFP von Natur aus autofluoreszierend ist, sind keine Fluorophor-gekoppelten Antikörper erforderlich, um die Lokalisierung von Zielproteinen aufzudecken, wodurch die Notwendigkeit vorbereitender Prozesse der Fixierung oder Permeabilisierung umgangen wird. In den letzten zwei Jahrzehnten wurden fluoreszierende Markierungen entwickelt, die das gesamte Wellenlängenspektrum abdecken10 und eine mehrfarbige Live-Bildgebung mehrerer Zielproteine gleichzeitig ermöglichen. Im Vergleich zu chemisch hergestellten Fluoreszenzfarbstoffen wie AlexaFluor oder ATTO ist die Autofluoreszenz dieser genetisch kodierten fluoreszierenden Proteine jedoch relativ schwach und instabil, wenn sie von endogenen Promotoren exprimiert werden, insbesondere während der Live-Bildgebung über längere Zeitskalen10. Während dieses Defizit durch die Überexpression fluoreszenzmarkierter Zielproteine gemildert werden kann, stören viele mit enzymatischen Aktivitäten wie Kinasen und Phosphatasen normale biologische Prozesse erheblich, wenn sie nicht auf physiologischem Niveau exprimiert werden.
Dieses Protokoll stellt eine Methode dar, die eine photostabile antikörperbasierte Zielbeleuchtung in einem Live-Bildaufbau ermöglicht, die im Wesentlichen Immunfluoreszenz ohne den Prozess der Fixierung oder Permeabilisierung ermöglicht (Abbildung 1). Durch eine einfache NHS-basierte primäre Aminreaktion11 kann man Fluoreszenzfarbstoffe wie AlexaFluor 488 oder 594 mit im Wesentlichen jedem primären Antikörper oder GFP/HA/Myc-Nanobody12 konjugieren. Unter Ausnutzung eines Entwicklungsmerkmals, dass alle embryonalen Zellen von Drosophila während des Synzytiumstadiums13 ein gemeinsames Zytoplasma teilen, kann man nach der Injektion von farbstoffkonjugierten Antikörpern eine Antigenbindung und Beleuchtung über ganze Embryonen erreichen. Mit der Erweiterung von Bibliotheken endogen markierter Proteine, die in Drosophila und anderen Modellsystemen verfügbar sind14, kann diese Methode die Anwendungen dieser Bibliotheken möglicherweise erweitern, indem sie die Dynamik von fluoreszenzmarkierten Proteinen mit geringer Häufigkeit und anderen nicht-fluoreszenzmarkierten Proteinen (HA/Myc-markierten) Proteinen in lebenden Geweben aufdeckt.
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Protocol
Die Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Genehmigungen der School of Life Sciences der SUSTech University durchgeführt. Der verwendete Organismus ist Drosophila melanogaster, und die Genotypen sind Notch-Knockin-GFP (Chromosom X) und Sqh-sqh-GFP (Chromosom II), die großzügigerweise von den Labors von Dr. François Schweisguth (Institut Pasteur) bzw. Dr. Jennifer Zallen (Sloan Kettering Institute) zur Verfügung gestellt wurden. Während sich dieses Protokoll hauptsächlich auf Aspekte der Antikörpermarkierung und der Lebendbildgebung konzentriert, finden Sie in den veröffentlichten Berichten detailliertere Beschreibungen der Entnahme und Injektion von Drosophila-Embryonen 15,16.
1. Fluoreszenzmarkierung von Antikörpern
- Vorzugsweise verwenden Sie monoklonale Antikörper oder Nanobodies für das interessierende Protein. Bereiten Sie die Stammkonzentration der Antikörper auf 1 mg/ml oder höher vor.
ANMERKUNG: In dieser Studie wird GFP-Nanobody (siehe Materialtabelle) als Beispiel verwendet. Der kommerziell erhältliche GFP-Nanobody ist in einer Konzentration von 1,0 mg/ml und einem Volumen von 250 μl verpackt. Zusätzlich wird ein kommerziell erhältliches Antikörper-Markierungskit (siehe Materialtabelle) verwendet, das Alexa Fluor 594 durch eine Succinimidylester-Reaktion11 an primäre Amine von Proteinen konjugiert. Wichtig ist, dass dieser Markierungsprozess die Antikörperkonzentration nicht signifikant verändert. - Bereiten Sie eine 1 M Natriumbicarbonatlösung vor, indem Sie Komponente B (im Antikörpermarkierungskit enthalten) in 1 ml deionisiertem Wasser resuspendieren.
- Stellen Sie die Antikörperkonzentration auf 1,0 mg/ml ein und fügen Sie dann 1/10des Volumens (10 μl für 100 μl GFP-Nanobody) der 1 M Natriumbicarbonatlösung hinzu.
- Geben Sie 110 μl der Antikörpermischung (aus Schritt 1.3) direkt in das Röhrchen mit dem Farbstoff Alexa Fluor 594. Zum Mischen umkehren (nicht wirbeln) und 1 h bei Raumtemperatur auf einem Rotator inkubieren.
- Stellen Sie die Reinigungssäule aus dem Konjugationskit zusammen (siehe Materialtabelle). Bereiten Sie ein 1,5-ml-Harzbett vor (im Antikörpermarkierungskit enthalten) und zentrifugieren Sie die Säule bei 1100 x g 3 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT), um überschüssige Flüssigkeit aus dem Harz zu entfernen.
- Die Reaktionsmischung (aus Schritt 1.4) wird tropfenweise auf die Oberseite der Harzsäule gegeben und bei 1100 x g 5 min bei 4 °C zentrifugiert, um den markierten Antikörper zu sammeln. Der gesammelte Antikörper sollte rosa erscheinen und das Volumen sollte etwas weniger als 100 μl betragen. In Folie eingewickelten oder dunklen Röhrchen bei 4 °C lagern.
2. Vorbereitung von Drosophila-Embryonen
- Setzen Sie 200 frisch geschlüpfte erwachsene Drosophila in einen zylinderförmigen Kunststoffkäfig (Durchmesser = 5 cm, Höhe = 8 cm) mit einem Männchen-Weibchen-Verhältnis von 1:10. Versiegeln Sie eine Seite mit einem porösen Metallgitter zur Belüftung und die andere Seite mit einer Fruchtsaft-/Hefepasten-Agarplatte.
- Wechseln Sie die Platte alle 12 Stunden für drei Tage vor der Embryonenentnahme. Dies ermöglicht die Synchronisierung der Drosophila-Eiablage und verbessert die Entnahmeeffizienz.
- Am Tag der Injektion wird der Käfig gegen eine Fruchtsaftplatte mit minimaler Hefepaste ausgetauscht und die Embryonen werden 1 h lang bei 25 °C gesammelt. Wenn die erste Entnahmerunde nicht genügend Embryonen (<50 Embryonen) ergibt, verwerfen Sie die erste Platte und wiederholen Sie diesen Schritt für eine zweite Entnahmerunde, bis innerhalb von 1 Stunde mehr als 100 Embryonen gelegt sind.
- Nehmen Sie die Platte aus dem Käfig, um die Eiablage zu stoppen, und inkubieren Sie weitere 2 Stunden bei 25 °C, um Embryonen zu erhalten, die 2-3 Stunden alt sind. Das richtige Stadium der Embryonen ist entscheidend für den Erfolg der Antikörperinjektion.
- Um die Eierschale der Embryonen zu entfernen, geben Sie 2 ml 50%iges Bleichmittel auf die Fruchtsaftplatte und lösen Sie die Embryonen vorsichtig mit einem Pinsel von der Platte (Abbildung 2A-4). Oft werden die Embryonen direkt auf die Hefepaste gelegt. In diesem Fall ist es akzeptabel, die Hefepaste in die Bleichlösung zu streichen, um alle Embryonen zu sammeln.
- Die schwimmenden Embryonen werden 2 Minuten lang in 50%igem Bleichmittel inkubiert und die Fruchtsaftplatte alle 30 Sekunden geschwenkt, um die Effizienz der Eierschalenentfernung zu verbessern.
- Übertragen Sie die Mischung aus Embryo und Bleichmittel, indem Sie sie in ein 70-μm-Nylonzellsieb gießen (Abbildung 2A-7). Waschen Sie die Embryonen gründlich mit einer Wasserflasche, um alle Rückstände von Bleichmittel und Hefepaste zu entfernen. Trocknen Sie das Zellsieb vollständig mit Papiertüchern ab und stellen Sie sicher, dass überschüssiges Wasser um die Embryonen herum entfernt wird.
3. Ausrichtung und Austrocknung des Embryos
- Bereiten Sie ein 5 cm x 5 cm x 0,5 cm (Breite, Länge, Höhe) 4%iges Agarose-Gel vor (Abbildung 2A-9) und lassen Sie das Gel auf Raumtemperatur abkühlen. Schneiden Sie einen 1 cm x 3 cm x 0,5 cm (Breite, Länge, Höhe) Agaroseblock mit einer sauberen Rasierklinge aus und legen Sie den Block auf einen Objektträger (Abbildung 2A-2). Untersuchen Sie den Gelblock unter dem Präpariergerät, um sicherzustellen, dass die Kanten gerade geschnitten sind und die Oberfläche flach und trocken ist.
- Übertragen Sie die Embryonen mit einem Pinsel aus dem Sieb auf den Gelblock. Verteilen Sie die Embryonen gleichmäßig entlang der Mittellinie des Blocks, indem Sie sie vorsichtig bürsten. Im Idealfall werden Embryonengruppen in einzelne Embryonen oder Dubletten getrennt, ohne sich zu berühren.
- Bereiten Sie eine Pinzette mit zwei Beinen vor, die fest zusammengeklebt sind, um eine einzige feine Spitze zu erhalten (Abbildung 2A-5). Nehmen Sie unter einem Sezierfernrohr einzelne Embryonen mit der Pinzette auf und legen Sie sie entlang der langen Kante des Gelblocks. Richten Sie 20-30 Embryonen aus und achten Sie darauf, dass ihre vordere und hintere Achse parallel zum Rand verläuft (Abbildung 2C).
- Pipettieren Sie 10 μl Heptankleber (siehe Materialtabelle) in die Mitte eines Deckglases von 24 mm x 50 mm (Abbildung 2A-1) und verteilen Sie den Klebstoff mit einer Pipettenspitze in einer rechteckigen Fläche von 0,5 cm x 3 cm. Warten Sie, bis der Kleber vollständig getrocknet ist, bevor Sie ihn verwenden.
- Platzieren Sie den Objektträger mit dem Gelblock an der Kante des Schreibtisches, so dass die Embryonen nach außen zeigen. Heben Sie das Deckglas mit Klebstoff mit einer Pinzette mit flacher Spitze (Abbildung 2A-6) an und halten Sie es ruhig auf den Embryonen, wobei die Klebstoffseite in einem geneigten Winkel von etwa 45 Grad zu den Embryonen zeigt.
HINWEIS: Drücken Sie das Deckglas vorsichtig gegen den Gelblock, so dass die Embryonen mit dem Kleber in Berührung kommen, und lassen Sie dann schnell den Druck los und heben Sie das Deckglas an. Die Höhe der Spannung ist entscheidend, damit die Embryonen stabil mit dem Klebstoff verbunden werden können, ohne zu stark gedrückt zu werden und zu platzen. - Pipettieren Sie 10 μl Wasser in die Mitte eines neuen Objektträgers und legen Sie das Deckglas mit den Embryonen darauf, wobei die Seite des Embryos nach oben zeigt (Abbildung 2B). Stellen Sie sicher, dass Sie Wasser anstelle von Nagellack oder anderem Klebstoff verwenden, um das Deckglas auf dem Objektträger zu befestigen, da diese Seite des Deckglases für Live-Aufnahmen direkt auf die konfokale Linse gelegt wird.
- Trocknen Sie die Embryonen in einer Austrocknungskammer (Abbildung 2A-3) (siehe Materialtabelle) für 10-15 Minuten, bis sich die Vitellinmembran faltet (Abbildung 2E). Die erforderliche Zeit kann mit der Luftfeuchtigkeit des Raumes variieren und sollte für jede Laborbedingung experimentell getestet werden.
- Pipettieren Sie 40 μl Halogenkohlenstofföl (eine Mischung aus Typ 27 und Typ 700 in einem Volumenverhältnis von 1:1, siehe Materialtabelle) an einem Ende des Embryostreifens. Kippen Sie den Objektträger, bis das Halogenkohlenstofföl die gesamte Oberfläche der Embryonen bedeckt.
4. Antikörper-Injektion und Bildgebung
- Bereiten Sie einige Injektionsglasnadeln mit einem Mikropipettenzieher vor (siehe Materialtabelle für Parametereinstellungen) und beladen Sie jede Nadel mit 5 μl AlexaFluor-markierter Antikörperlösung (aus Schritt 1.6).
- Legen Sie ein Deckglas von 25 mm x 25 mm auf einen Objektträger. Pipettieren Sie 40 μl Halogenkohlenstofföl und verteilen Sie es entlang des Randes des Deckglases.
- Richten Sie unter dem Injektionsfernrohr die Spitze der Nadel an der Kante des Deckglases unter Öl aus. Stellen Sie den Einspritzluftdruck der Picopumpe ein (siehe Materialtabelle), so dass eine Pumpe eine mit Antikörpern gefüllte Blase erzeugt. Der Blasendurchmesser sollte auf 20-50 μm begrenzt werden (Abbildung 2F).
- Ersetzen Sie den leeren Objektträger durch einen Objektträger mit Embryonen unter Öl. Richten Sie die Spitze der Injektionsnadel senkrecht zur vorderen und hinteren Achse der Embryonen aus (Abbildung 2D,G).
- Überprüfen Sie das Stadium der Embryonen, um sicherzustellen, dass die meisten Embryonen mit der Zellularisierung begonnen haben, aber noch nicht mit der Gastrulation begonnen haben (Stadium 4 und Stadium 5) und als Synzytium verbleiben (Abbildung 2F,G).
HINWEIS: Das Kennzeichen dieses Stadiums ist das Fehlen von Rillen oder Falten und das Vorhandensein eines ovalen, dunkel gefärbten Dottersacks, der in der Mitte des Embryos sichtbar ist. Die morphologische Charakterisierung des Embryostadiums unter Öl basiert auf dem Buchkapitel "Stadien der Embryogenese von Drosophila" von Volker Hartenstein17. - Verwenden Sie den X-Y-Stufe-Manipulator, um die Embryonen in Richtung der Nadel zu bewegen, bis die Spitze in der Mitte des Dotters ankommt. Pumpen Sie zwei- bis dreimal, um Antikörper in das Eigelb zu injizieren. Eine erfolgreiche Injektion wird durch das schnelle Verschwinden der Vitellinmembranfalte angezeigt, da die Embryonen durch die Antikörperlösung an Volumen gewinnen (Abbildung 2G).
- Verwenden Sie den Manipulator der X-Y-Stufe, um die Embryonen nach der Injektion von der Nadel wegzubewegen und nach unten zum nächsten Embryo zu bewegen. Wiederholen Sie Schritt 6, bis alle Embryonen auf dem Objektträger injiziert sind.
- Übertragen Sie den Objektträger mit den injizierten Embryonen in eine Feuchtigkeitskammer (Abbildung 2A-8). Bei 25 °C inkubieren, bis das gewünschte Stadium der Embryonalentwicklung erreicht ist.
- Heben Sie das 24 mm x 50 mm große Deckglas vom Objektträger ab und legen Sie es direkt in den Objektträgerhalter des Mikroskops. Die Seite ohne Embryonen wird sich den Zielen stellen. Lokalisieren Sie die Embryonen mit einem Objektiv mit geringer Vergrößerung unter Hellfeldbeleuchtung und wechseln Sie zu einem 40-fachen oder 63-fachen Objektiv für hochauflösende fluoreszierende Live-Aufnahmen.
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Representative Results
Um die Vorteile der Antikörper-Injektionsmethode gegenüber der Fluoreszenz-Tag-basierten Live-Bildgebung oder Immunfluoreszenz zu demonstrieren, werden zwei Fallstudien vorgestellt, die die dynamische Lokalisierung eines Transmembranrezeptors mit geringer Häufigkeit, Notch, und eine Art posttranslationaler Modifikation, die als Tyrosinphosphorylierung bezeichnet wird, in lebenden Embryonen charakterisieren.
Die Notch-Signalaktivität spielt eine wichtige Rolle bei der Bestimmung des Zellschicksals während der Embryogenese und der Homöostase adulter Organe18,19. Nach der Aktivierung durch seine Liganden Delta/Jagged20 wird die intrazelluläre Domäne des Transmembranrezeptors Notch gespalten und in den Zellkern21 freigesetzt, wodurch nachgeschaltete Transkriptionsprogramme initiiert werden, um Veränderungen des Zellschicksalsvoranzutreiben 22. Die statische Lokalisation des Notch-Rezeptors wurde durch Immunfluoreszenz in Formaldehyd-fixierten Geweben gut charakterisiert. Die dynamische Lokalisation von Notch während der Ligandenbindung oder des intrazellulären Spaltungsprozesses ist jedoch weitgehend unbekannt23, da es keine Methode gibt, um dieses relativ häufig vorkommende Protein mit hoher Geschwindigkeit live abzubilden. Hier injizierten wir AlexaFluor-konjugierten GFP-Nanobodys in Embryonen, die GFP-markiertes Notch aus dem endogenen Locus20 exprimierten. Ohne Injektion ist Notch-GFP unter Standard-Live-Imaging-Bedingungen kaum nachweisbar, und das Fluoreszenzsignal bleicht während der Zeitrafferaufnahme schnell aus. Nach der Injektion verbessert sich das Signal-Rausch-Verhältnis des Notch-Rezeptors signifikant, vergleichbar mit der Signalqualität der Immunfluoreszenz (Abbildung 3A). Darüber hinaus ermöglicht die Antikörperinjektion die zeitliche Charakterisierung der Notch-Lokalisierung in 45-s-Intervallen, ohne dass es zu einem offensichtlichen Verlust der Signalintensität über ein 5-minütiges Bildgebungsfenster kommt (Abbildung 3B).
Die Tyrosinphosphorylierung ist eine wichtige Art der posttranslationalen Proteinmodifikation, die die Signaltransduktion in vielen biologischen Signalwegen vermittelt24. Hochspezifische monoklonale Antikörper (wie PY20 und 4G10) gegen Phosphotyrosin (p-Tyr) wurden entwickelt, um die Lokalisation und das Niveau der gesamten Tyrosinphosphorylierung mit Hilfe von Immunfluoreszenz und Western Blots zu charakterisieren25. Während keine fluoreszierenden Markierungen Änderungen der Phosphorylierung verfolgen können, müssen Gewebe oder Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten fixiert und gefärbt oder lysiert und gelottet werden, um Momentaufnahmen des Phosphorylierungsstatus im Laufe der Zeit zu erhalten, um die Kinetik der Tyrosinphosphorylierung bei der Signalaktivierungzu untersuchen 26 (z. B. Behandlung mit Wachstumsfaktoren). Das Zeitintervall dieses Ansatzes ist mindestens wenige Minuten lang und aufgrund der variablen Zeit, die für Verfahren wie Fixierung oder Zelllyse benötigt wird, von Natur aus ungenau.
Hier wird der Nachweis erbracht, dass die Antikörper-Injektionsmethode die direkte Visualisierung des Phosphorylierungsstatus in lebenden Embryonen ermöglicht, indem die Lokalisation und Intensitätsänderungen der Tyrosinphosphorylierung in regelmäßigen Zeitintervallen auf Sekundenebene verfolgt werden. Der AlexaFluor-konjugierte PY20-Antikörper wurde in Embryonen injiziert, die eine GFP-markierte Myosin-Leichtkette exprimierten, und führte eine zweifarbige Live-Bildgebung in Intervallen von 45 s durch. Wie bereits gezeigt, ist die Tyrosinphosphorylierung an trizellulären Verbindungen27 stark angereichert, ein Muster, das auch durch Immunfluoreszenz rekapituliert wird (Abbildung 4A). Interessanterweise zeigte die Live-Bildgebung auch eine neuartige, zweite Population des p-Tyr-Signals unterhalb des Zentrums der apikalen Membran, die mit Immunfluoreszenz nicht beobachtet wird (Abbildung 4B). Durch zweifarbige Bildgebung wurde festgestellt, dass sich diese Population des p-Tyr-Signals in unmittelbarer Nähe des medialen Myosins befindet (Abbildung 4B, Nahaufnahmen), einer Subpopulation von Myosin28 , die ebenfalls nur unter Live-Imaging-Bedingungen ausgeprägt ist, aber mittels Immunfluoreszenz kaum nachweisbar ist. Darüber hinaus weist die mediale Population von p-Tyr ähnliche pulsierende Koaleszenz- und Dissipationsmuster auf (Abbildung 4C), wie zuvor für mediales Myosin28 gezeigt wurde. Die Identität und Funktion einer medialen Subpopulation von p-Tyr ist noch unbekannt. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass die Antikörper-Injektionsmethode traditionelle Ansätze zur Charakterisierung des Verhaltens von Proteinen mit geringer Häufigkeit hervorragend ergänzen und neue Lokalisierungsmuster aufdecken könnte, die während des Prozesses der Immunfluoreszenz gestört worden sein könnten.
Abbildung 1: Arbeitsablauf bei der Injektion von Antikörpern. Schematischer Arbeitsablauf, der die Schritte der Antikörperinjektionsmethode veranschaulicht. Der gesamte Prozess, von der Embryonenentnahme bis zur Injektion von Antikörpern, dauert in der Regel etwa 4-5 Stunden. Nach der Injektion von Antikörpern können die Embryonen in einer Feuchtigkeitskammer in das gewünschte Entwicklungsstadium inkubiert werden, bevor sie lebend aufgesetzt werden. AEL, nach der Eiablage; RT, Raumtemperatur; Ab, Antikörper. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Ausrichtung und Injektion des Embryos. (A) Übersicht über die vor der Injektion erforderlichen Gegenstände, einschließlich Deckglas, Objektträger, Trocknungsbox, Pinsel, Pinzette, Zellsieb, Feuchtigkeitskammer und Agarose-Gel. (B) Ausgerichtete Embryonen, die in der Mitte des Deckglases an Heptankleber befestigt und auf Trocknungsperlen gelegt werden. (C) Ausrichtung der vorder-hinteren Achse der Embryonen parallel zum Rand des Agarose-Gels. (D) Überblick über den Einspritzaufbau. (E) Vergleich der Embryomorphologie vor und nach dem Austrocknungsprozess, wobei der Schwerpunkt auf der Falte der Vitellinmembran nach der Austrocknung liegt. (F) Größe der Injektionsblase nach einmaligem Drücken der Picopumpe. (G) Vergleich der Embryomorphologie vor und nach Antikörperinjektion, wobei das Verschwinden von Membranfalten nach der Injektion hervorgehoben wird. (E-G) wurden unter einem Objektiv mit 10-facher Vergrößerung mittels Hellfeldmikroskopie aufgenommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Live-Bildgebung des Notch-Rezeptors in frühen Embryonen. (A) Lokalisierung des endogenen GFP-markierten Notch-Rezeptors durch Immunfluoreszenz (links), direkte Live-Bildgebung basierend auf GFP-Autofluoreszenz (Mitte) und AlexaFluor 594-konjugierte GFP-Nanobody-Injektion (rechts). (B) Dynamische Lokalisierung von Notch-GFP, aufgenommen in 45 s Intervallen nach Antikörperinjektion. Alle Bilder wurden mit dem vorderen Teil der Embryonen nach links und der ventralen Seite nach unten aufgenommen. Maßstabsbalken = 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Live-Bildgebung von embryonalen Phosphotyrosinmustern. (A) Lokalisierung von phosphoryliertem Tyrosin (p-Tyr) in fixierten Embryonen durch Immunfluoreszenz. (B) Lokalisierung von p-Tyr (magenta) in lebenden Embryonen, die GFP-markierte Myosin-Leichtkette (grün) exprimieren. Der weiß gestrichelte Kasten zeigt Nahaufnahmen der medialen Population von Phosphotyrosin und Myosin unter der apikalen Membran. Maßstabsbalken = 10 μm. (C) Lokalisierung von p-Tyr und GFP-Myosin, alle 45 s in lebenden Embryonen. Weiße Pfeile zeigen die mediale Population von p-Tyr und Myosin an. Alle Bilder wurden mit dem vorderen Teil der Embryonen nach links und der ventralen Seite nach unten aufgenommen. Maßstabsbalken = 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Dieses vorgestellte Verfahren beschreibt die spezielle Methode der Fluoreszenzmarkierung mit maßgeschneiderten Antikörpern und der anschließenden Injektion in Drosophila-Embryonen im Frühstadium. Diese Technik ermöglicht die Echtzeit-Visualisierung von Proteinen oder posttranslationalen Modifikationen, die in geringen Mengen vorliegen und mit herkömmlichen GFP/mCherry-Markierungsmethoden typischerweise nur schwer zu beobachten sind.
Vorsicht ist geboten, wenn diese Methode erweitert wird, um quantitative Vergleiche zwischen Wildtyp- und mutierten Embryonen anzustellen. Während die Konzentration von primären und sekundären Antikörpern in der Immunfluoreszenz zwischen Kontroll- und Versuchsgruppe gleich gehalten werden kann, können die Menge der injizierten Antikörper und die Markierungseffizienz zwischen den Embryonen variieren. Daher sollte sich die quantitative Analyse darauf beschränken, Änderungen der Fluoreszenzintensität im Laufe der Zeit zu verfolgen oder Korrelationsanalysen mit Signalen anderer Kanäle im selben Embryo durchzuführen, wenn eine mehrfarbige Live-Bildgebung durchgeführt wird. Zum Beispiel können Kolokalisations- und Korrelationsanalysen mit p-Tyr- und Myosin-Intensitätendurchgeführt werden 27, während p-Tyr-Intensitäten nicht direkt zwischen Wildtyp- und Gen-X-Knockdown-Embryonen mit der Antikörper-Injektionsmethode verglichen werden können.
Ähnlich wie bei anderen Fluoreszenz-Tag-basierten Ansätzen zur Untersuchung der Proteindynamik könnte die Antikörperbindung möglicherweise die Aktivität, den Transport oder die Lokalisierung von Zielproteinen verändern. Daher werden monoklonale Antikörper oder Nanobodies polyklonalen Antikörpern zur Injektion vorgezogen. Da die Epitope von monoklonalen Antikörpern oder Nanobodies gut definiert sind, konnte auf der Grundlage von Alpha-Faltungsstrukturen modelliert werden, ob die Blockierung dieser Epitope mit Antikörpern die Proteinaktivität verändert12,25. Auf der anderen Seite sind Epitope von polyklonalen Antikörpern nicht genau abgegrenzt, und ihre Bindung könnte möglicherweise die Lokalisierung oder Aktivität von Proteinen verändern, wenn katalytische Taschen oder Signalpeptide von Zielproteinen blockiert werden. Zweitens können Antikörper andere unspezifische Epitope als Zielproteine erkennen, insbesondere wenn man bedenkt, dass es hier keine "Auswaschungsschritte" wie bei der Immunfluoreszenz gibt, um unspezifische Bindungen mit geringerer Affinität zu entfernen. Daher ist es wichtig, Kontrollgruppen zu haben, wie z. B. die Injektion von Antikörpern in Zellen, denen das Epitop fehlt, um zu überprüfen, ob das beobachtete Signal wirklich die Zielproteine oder andere unspezifische Epitope widerspiegelt.
Die Injektion von Antikörpern unterscheidet sich vom Versuchsaufbau her nicht von der Injektion von siRNA oder CRISPR-gRNAs. Daher sollten die meisten zellulären Systeme, die für Injektionen geeignet sind, mit der Antikörper-Injektionsmethode kompatibel sein. In Drosophila-Embryonen sind Alexa-Fluor-konjugierte Antikörper während der Entwicklung stabil, und Fluoreszenzsignale bleiben auch nach Stunden der Embryogenese nachweisbar. Für andere Systeme wie Xenopus- oder Zebrafisch-Embryonen sollten die Konzentration und das Injektionsvolumen der Antikörper empirisch durch serielle Verdünnungen getestet werden, um eine ideale Markierungseffizienz zu erreichen. Darüber hinaus könnten alternative Fluoreszenzfarbstoffe wie ATTO10 möglicherweise ein besseres Signal-Rausch-Verhältnis und eine bessere Wasserlöslichkeit bieten.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu deklarieren.
Acknowledgments
Wir danken Dr. Jennifer A. Zallen für die Bereitstellung der Sqh-GFP Drosophila-Linie und die Unterstützung bei der ersten Entwicklung dieser Technik sowie Dr. Francois Schweisguth für die Bereitstellung der Notch-GFP Drosophila-Linie . Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (32270809) an S.H.Yu, großzügiger finanzieller und personeller Unterstützung von der School of Life Sciences, SUSTech, und von Y. Yan von der Shenzhen Science and Technology Innovation Commission/JCYJ20200109140201722 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sangon Biotech | A620014 | |
| Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit | Invitrogen | A20185 | Purification column from step 1.6 is included in this kit |
| Biological Microscope | SOPTOP | EX20 | Eyepiece lens: PL 10X/20. Objective lens: 10x/0.25 |
| Bleach | Clorox® | ||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5245 | |
| Cell Strainer | FALCON | 352350 | |
| Desiccation chamber | LOCK&LOCK | HSM8200 | 320ml |
| Dissecting Microscope | Mshot | MZ62 | Eyepiece lens: WF10X/22mm. |
| Double-sided Tape | Scotch | 665 | |
| Fine Super Tweezer | VETUS | ST-14 | |
| Fisherbrand™ Cover Glasses: Rectangles | Fisherbrand | 12-545F | |
| Fisherbrand™ Superfrost™ Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Forcep | VETUS | 33A-SA | |
| Halocarbon oil 27 | Sigma-Aldrich | H8773-100ML | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898-100ML | |
| Heptane | Sigma-Aldrich | H2198-1L | Heptane glue is made of double-sided tape immersed in heptane |
| Dehydration reagent | TOKAI | 1-7315-01 | Fill to 90% volume of the dessication chamber |
| Manual Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
| Micropipette puller | World Precision Instruments | PUL-1000 | Procedure: step 1, Heat: 290, Force:300, Distance:1.00, Delay:50. Step 2, Heat: 290, Force:300, Distance:2.21, Delay:50 |
| Pneumatic picopump | World Precision Instruments | PV 830 | Eject: 20 psi; Range: 100ms; Duration: timed |
| PY20 | Santa Cruz | SC-508 | |
| Square petri dishes | Biosharp | BS-100-SD | |
| GFP nanobody | Chromotek | gt |
References
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- Arthur, G., et al.
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