Overview
ショウジョウバエ胚は保護外膜に囲まれている。胚にアクセスするために、絨毛膜の最も外側にある絨毛は、しばしば除去される。このビデオでは、次亜塩素酸ナトリウムを使用したデコールリオネーションの一般的な方法について説明します。このプロトコル例は、無菌またはグノトビオティック動物飼育に必要な滅菌技術を用いながら、手順を示す。
Protocol
このプロトコルは、Koyleらからの抜粋であり、無糖およびグノトビオティック条件下でのフルーツフライショウジョウバエメラノガスターの飼育、J.Vis. Exp. (2016年)
1. 産卵ケージの準備
- 100mlの水、10gの醸造酵母、10gのグルコース、寒天1gをマイクロウェーブして、ブドウジュース寒天プレートを作ります。ステップ1.1で3回沸騰させ、冷凍ブドウジュース濃縮物10gを加えて、寒天プレートに卵の視認性を高める。
- 寒天が55°Cに冷却されたら、100ミリメートルペトリ皿に20ミリリットルを注ぎ、固化することができます。
- 1gの醸造酵母と15gの水を混ぜて、酵母ペーストで寒天プレートの表面を覆います。寒天プレートに酵母ペーストを注ぎ、表面が覆われていることを確認し、余分なものを注ぎ、薄い酵母残渣を残します。複数のプレートを使用する場合は、ペーストを複数のプレートに順次注ぎ込むことができます。
- 寒天プレートをケージの底に移します。
注: 32オンスデリコンテナは、アクリルフライケージの代用品です。- 上部に穴を開け、無毒な接着剤で穴の上に通気性のメッシュを接着することにより、32オンスデリ容器の蓋を作ります。接着剤が水溶性である場合は、蓋への水の暴露を防ぎます。
- コンテナに200〜300ハエを移し、蓋をします。メッシュで保護された穴を空のペトリ皿の蓋で覆い、寒天表面からの蒸発を防ぎ、必要に応じて蓋の中に湿ったティッシュペーパーを追加します。インキュベートは16〜20時間一晩25°Cで飛ぶ。
2. 卵を集める
- プラスチックのブッシングにナイロンメッシュを配置することにより、卵の収集のためのふるいを準備します。
- 卵を持つプレートを取り出すために、空の容器に移してケージからハエを取り除きます。翌日に同じハエが使用される場合は、酵母の新しいブドウジュース寒天プレートを含む新しいケージにすぐに移します。ハエは3-5の連続した日のために使用することができる
- きれいな絵筆で寒天から死んだハエを取り除き、寒天を壊さないことに注意してください。
- 寒天板を蒸留水ですすい、寒天表面から卵を優しくブラッシングし、スラリーをメッシュの上に注いで卵を採取します。卵の全部または大部分が寒天プレートから取り除かれるまで3~4回繰り返します。
3. デコールリオネート卵と滅菌食への転送
- 70%エタノールを内部(側面を含む)にスプレーしてバイオセーフティキャビネットを準備します。ラボティッシュで底を拭き、約15分間UV光でボンネットを殺菌します。エタノールを噴霧し、すぐにバイオセーフティキャビネットに入れることで、非生物学的な供給(標本カップ、ペイントブラシ、鉗子、廃液、400ml滅菌水、および100mlの次亜塩素酸ナトリウム)を殺菌します。15分間、UV光で殺菌します。
- 卵でブッシュを120mlの標本カップまたは他の滅菌容器に入れることによって、2回の次亜塩素酸ナトリウムの最初の水解を開始します。リムのすぐ下まで、0.6%次亜塩素酸ナトリウム溶液をブッシングにゆっくりと90ml流します。
- 卵を2.5分間すすいでください。鉗子を使用して卵を定期的に再中断し、次亜塩素酸溶液中でブッシングを上下に動かします。
- バイオセーフティキャビネット内の90ml漂白剤で事前に充填された2番目の標本カップに直接ブッシュを移します。
- バイオセーフティキャビネット内でステップ3.3を繰り返します。2回目の漂白処理の終わりに、卵はブッシングの側面に付着し始めるはずです。
- バイオセーフティキャビネットでステップ3.7-3.8を実行します。
- 漂白剤を捨て、滅菌水でブッシングを3回洗います。鉗子でブッシングを動かすことによって、各洗浄中に卵を数回再中断します。3回目の洗浄の終わりまでに、ほとんどの卵はブッシングの側面に取り付けられるべきです。
- エタノールで殺菌したペイントブラシを使用して、ブッシングの側面から無菌食に卵を移す。卵を個別に、または小さなバッチで転送します。バイアルあたり30〜50個の卵を目指します。酸素がチューブに入るようにキャップを緩めたままにしておきます。
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