Overview
Drosophila-embryoet er omgivet af beskyttende ydre membraner. For at få adgang til embryoet fjernes chorion-den yderste af membranerne ofte. Denne video beskriver en almindeligt anvendt metode til dechorionation ved hjælp af natriumhypochlorit. Eksempelprotokollen demonstrerer proceduren, mens der anvendes sterile teknikker, der er nødvendige for akse- eller gnotobiotisk opdræt af dyr.
Protocol
Denne protokol er et uddrag fra Koyle et al.,Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic og Gnotobiotic Conditions, J. Vis. Exp. (2016).
1. Forbered æglæggende bure
- Lav druesaft agar plader ved mikrowaving 100 ml vand, 10 g bryggersgær, 10 g glukose og 1 g agar. Bring i kog 3 gange i trin 1.1 og tilsæt 10 g frossen druesaftkoncentrat for at øge synligheden af æg på agarpladen.
- Når agaren er afkølet til 55 °C, hældes 20 ml i 100 mm petriskåle og størknes.
- Dæk overfladen af agarpladerne med en gærpasta ved at blande 1 g bryggergær med 15 g vand. Hæld gærpasta på agarpladen og sørg for, at overfladen er dækket, og hæld derefter det overskydende af, hvilket efterlader en tynd gærrester bag. Hvis der anvendes flere plader, kan pastaen hældes sekventielt til flere plader.
- Overfør agarplader i bunden af et bur.
BEMÆRK: En 32 ounce deli container er en god erstatning for akryl flyve bure.- Lav låg til 32 ounce deli containere ved at skære et hul i toppen og limning en åndbar maske over hullet med ikke-giftige lim. Hvis limen er vandopløselig forhindre vand eksponering for låget.
- Overfør 200-300 fluer i beholderen og dæk med låg. Dæk det netbeskyttede hul med et tomt petriskålslåg for at forhindre fordampning fra agaroverfladen og tilsæt eventuelt et fugtigt silkepapir inde i låget. Inkuber fluer ved 25 °C natten over i 16-20 timer.
2. Saml æg
- Forbered en sigte til ægopsamling ved at placere nylonnet i en plastbøsning.
- For at hente pladen med æg på det, fjern fluer fra buret ved at overføre til en tom beholder. Hvis samme fluer vil blive brugt næste dag, overføres straks til et nyt bur, der indeholder en friskgært druesaft agar plade. Fluer kan bruges i 3-5 sekventielle dage
- Fjern døde fluer fra agaren med en ren pensel, og pas på ikke at bryde agaren op.
- Saml æg ved at skylle agarpladen med destilleret vand, forsigtigt børste æg fra agaroverfladen og hælde gyllen over masken. Gentag 3-4 gange, indtil alle eller de fleste af æggene er fjernet fra agarpladen.
3. Dechorionate Æg og overførsel til steril kost
- Forbered biosikkerhedsskabet ved at sprøjte indersiden (inklusive sider) med 70% ethanol. Tør bunden med et laboratorievæv, og steriliser emhætten med UV-lys i ~ 15 min. Alle ikke-biologiske forsyninger steriliseres (prøvekopper, pensel, pincet, affaldsbeholder, 400 ml steriliseret vand og 100 ml 0,6% natriumhypochlorit) ved sprøjtning med ethanol og straks anbringelse i biosikkerhedsskabet. Steriliser med UV-lys i 15 minutter.
- Start den første af 2 natriumhypochlorit vasker ved at placere bøsningen med æggene i en 120 ml prøvekop eller anden steril beholder. Hæld langsomt ~ 90 ml 0,6% natriumhypochloritopløsning i bøsningen indtil lige under kanten.
- Skyl æg i 2,5 min. Regelmæssigt suspendere æggene igen ved hjælp af pincet til at flytte bøsningen op og ned i hypochloritopløsningen.
- Bøsningen overføres direkte til en anden prøvekop, forfyldt med 90 ml blegemiddel, inde i biosikkerhedsskabet.
- Gentag trin 3.3 inde i biosikkerhedsskabet. I slutningen af den anden blegemiddelbehandling skal æggene begynde at klæbe til siderne af bøsningen.
- Udfør trin 3.7-3.8 i biosikkerhedsskabet.
- Kassér blegemidlet og vask bøsningen med sterilt vand 3 gange. Suspendere æggene flere gange under hver vask ved at flytte bøsningen med pincet. Ved udgangen af den tredje vask skal de fleste æg fastgøres til siden af bøsningen.
- Ved hjælp af en pensel steriliseret i ethanol overføres æg fra siden af bøsningen til den sterile kost. Overfør æg individuelt eller i små partier. Sigt efter 30-50 æg pr. hætteglas. Lad hætterne løsne, så der kommer ilt ind i røret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
