मानव टी लिम्फोसाइट अलगाव, और प्रवासन की संस्कृति विश्लेषण इन विट्रो में Published: June 1, 2010 doi: 10.3791/2017

DOI

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Craig T. Lefort¹, Minsoo Kim¹

¹Center for Vaccine Biology and Immunology, University of Rochester

Summary

टी लिम्फोसाइट प्रवास lymphoid अंगों, vasculature से बाहर निकलने के लिए घर वापस आना के दौरान होता है, और परिधि के ऊतकों में प्रवेश. यहाँ, हम एक प्रोटोकॉल है कि टी लिम्फोसाइट प्रवास विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता का वर्णन

Abstract

टी lymphocytes के प्रवास कोशिका की सतह integrins के अन्य कोशिकाओं पर या बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन के साथ व्यक्त ligands के साथ चिपकने वाला बातचीत शामिल है. सटीक integrins spatiotemporal एक कम आत्मीयता राज्य से सेल के अग्रणी धार पर एक उच्च आत्मीयता राज्य के लिए सक्रियण टी लिम्फोसाइट प्रवास के लिए महत्वपूर्ण है

Protocol

1. मानव टी lymphocytes के अलगाव

1. एक स्वस्थ दाता से मानव रक्त से प्राप्त करते हैं. रक्त अगले कदम के लिए आगे बढ़ने से पहले कमरे के तापमान (~ 30 मिनट) शांत करने के लिए अनुमति दें.
2. धीरे से एक 8 एमएल polystyrene दौर नीचे ट्यूब में कमरे के तापमान polymorph घनत्व ढाल मीडिया के 3 एमएल विंदुक. धीरे polymorph मीडिया के शीर्ष पर पूरे रक्त के 3 एमएल जोड़ें. यह महत्वपूर्ण है दो अभिकर्मकों के मिश्रण से बचने के लिए.
3. कमरे के तापमान पर 45 मिनट के लिए 500 XG पर ट्यूबों अपकेंद्रित्र.
4. Centrifugation के बाद, परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear (PBMC) अब शीर्ष सेल परत में अन्य रक्त घटकों से अलग है. PBMC परत ऊपर से नीचे दिखाई देता है, पहली बादल बैंड के रूप में.
5. ध्यान से स्पष्ट पीले रंग रक्त के ऊपरी PBMC परत के ऊपर, चरण निकालने के लिए, और फिर एक P1000 micropipette का उपयोग करने के लिए एक 15 एमएल या 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब PBMC परत हस्तांतरण.
6. PBMC पीबीएस के साथ दो बार, धो 500 XG में 5 मिनट प्रत्येक समय के लिए कोशिकाओं centrifuging. सतह पर तैरनेवाला प्रत्येक धोने के बाद कुछ हद तक बादल जाएगा.

2. मानव टी lymphocytes की संस्कृति

1. एक विंदुक का प्रयोग, 20 एमएल RPMI +१६४० 10% FBS युक्त मीडिया में एक T-75 संस्कृति फ्लास्क PBMC हस्तांतरण करने के लिए, 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, और एक μg / एमएल phytohemagglutinin (पीएचए).
2. 37 में सेते डिग्री सेल्सियस और 5% कम से कम 1 घंटे और 24 घंटे के _लिए सीओ 2 . यह कदम monocytes, जो कुप्पी सतह के अनुयायी हो, लिम्फोसाइटों है कि निलंबन में रहने से अलग हो जाएगा अनुमति देता है. यदि एक कम ऊष्मायन (1 घंटा) इस कदम पर प्रयोग किया जाता है, यह पीएचए के साथ सप्लीमेंट के रूप में 2.1 चरण में निर्दिष्ट के बिना 10% FBS और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन युक्त RPMI 1640 मीडिया का उपयोग करने के लिए स्वीकार्य है.
3. ध्यान से कुप्पी से मीडिया के सभी निकालने के लिए, यह एक 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब को जोड़ने के लिए, और 5 मिनट के लिए 500 XG पर अपकेंद्रित्र.
4. Resuspend सेल गोली, जो अब मुख्य रूप से लिम्फोसाइटों शामिल है, और एक नई टी 75 25 एमएल RPMI +१,६४० 10% FBS युक्त मीडिया युक्त कुप्पी कोशिकाओं हस्तांतरण, 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, और 1 μg / एमएल पीएचए.
5. 3 दिन (2 दिन अगर PBMC के प्रारंभिक ऊष्मायन रातोंरात था) के लिए 37 ° C पर सेते हैं. विकास के 24 घंटे के बाद, यह ताजा मीडिया के 15-20 एमएल जोड़ सकते हैं और एक बड़ा टी 175 फ्लास्क करने के लिए स्थानांतरण करने के लिए आवश्यक हो सकता है.
6. 3 दिनों के बाद एक विंदुक उपयोग फ्लास्क और हस्तांतरण से एक 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब मीडिया और निलंबित लिम्फोसाइटों को हटाने के लिए. 5 मिनट के लिए 500 XG अपकेंद्रित्र.
7. एक नई T-75 या T-175 10% FBS के साथ 25 (T-75) एमएल या 50 एमएल (T-175) +१६४० RPMI युक्त कुप्पी सेल गोली और हस्तांतरण कोशिकाओं Resuspend, 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, और 20 एनजी एमएल / मानव आईएल-2 या आईएल-15.
8. लिम्फोसाइटों 4-7 दिनों के लिए आगे बढ़ें. यदि एक फ्लास्क T-75 के साथ शुरू, संस्कृति के विस्तार और 1-2 दिनों के बाद एक T-175 फ्लास्क को हस्तांतरित होने की आवश्यकता होगी.

3. इन विट्रो लिम्फोसाइट प्रवासन परख

1. परख प्रवास से पहले एक दिन, कोट एक गिलास नीचे 0.17 पर 4 मिमी 20 μg एमएल / या PBS में जी रातोंरात प्रोटीन के साथ पकवान डिग्री सेल्सियस
2. पीबीएस के साथ पकवान बड़े पैमाने पर धो.
3. मानव ICAM-1/Fc (10 μg / एमएल) और मानव पकवान पीबीएस समाधान में इन अभिकर्मकों जोड़ने और कमरे के तापमान पर 4 घंटे incubating द्वारा एसडीएफ 1 (2 μg / एमएल). स्थिर
4. पहली बार संस्कृति में एक hemacytometer का उपयोग T-175 फ्लास्क में सेल घनत्व निर्धारण टी lymphocytes तैयार करें. एक सेल प्रवास विश्लेषण के लिए उपयुक्त घनत्व को प्राप्त करने के प्रति ^2-5 लगभग x 10 5 कोशिकाओं पकवान इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
5. टी lymphocytes पीबीएस के साथ दो बार और फिर धो 1 एमएल एल 15 1 मिलीग्राम / एमएल डी - ग्लूकोज युक्त मीडिया में resuspend.
6. ICAM-1/Fc और पीबीएस के साथ बड़े पैमाने पर एसडीएफ -1 के साथ लेपित पकवान धो लें.
7. 1 एमएल मीडिया में टी lymphocytes डिश के लिए स्थानांतरण और उन्हें 37 में बनाए रखने डिग्री सेल्सियस

4. एनआईएस तत्वों सॉफ्टवेयर का उपयोग एक छवि अनुक्रम कैप्चरिंग

1. एनआईएस तत्वों सॉफ्टवेयर खोलें.
2. कैमरा सेटिंग्स मेनू में, दोनों रहते इमेजिंग और छवि पर कब्जा के लिए मोड "के रूप में 2x2 binning" चुनें.
3. अनुप्रयोग मेनू पर जाएँ और / परिभाषित भागो प्रयोग चुनें.
4. छवियों और छवि पर कब्जा अनुक्रम की कुल लंबाई के बीच समय की लंबाई चुनें.
5. छवि अधिग्रहण शुरू करने के लिए "भागो" बटन दबाएँ.
6. कक्ष लगाया जा सकता है और प्रवास मापदंडों (वेग, पथ लंबाई, विस्थापन, आदि) एक ImageJ, AutoQuant या Volocity (चित्रा 1) सहित कई सॉफ्टवेयर संकुल, के उपयोग मात्रा निर्धारित है.
7. एक उत्पन्न xy "मकड़ी का जाला भूखंड," निर्देशांक के लिए प्रत्येक कोशिका और timepoint (चित्रा 2) एकत्र कर रहे हैं और प्रत्येक कोशिका के मूल में एक आम के लिए प्रारंभ बिंदु (चित्रा 3) के साथ एक ग्राफ पर पेश.

5. प्रतिनिधि परिणाम

या तो आईएल-2 या आईएल -15, टी lymphocytes की उपस्थिति में संस्कृति के 6 दिन> कोशिकाओं के 98% के रूप में सकारात्मक CD3 के रूप में अच्छी तरह से सकारात्मक CD4 और / या सीडी 8 धुंधला धुंधला द्वारा निर्धारित कर. आईएल -2 के लिए, हम 83% सीडी 4 + कोशिकाओं, 15 सीडी 8% + और <1% सीडी 4 CD8 + + कोशिकाओं पाया. आईएल-15 के लिए, हम 88% सीडी 4 + कोशिकाओं, 11% + CD8 और <1% सीडी 4 सीडी 8 + + कोशिकाओं पाया. टी ICAM-1/SDF-1 substrates पर लिम्फोसाइट प्रवास के दौरान, कोशिकाओं लगभग 15 सुक्ष्ममापी / मिनट है कि एक 1 घंटे के समय अवधि में निरंतर किया जा सकता है है की एक वेग का प्रदर्शन किया. टी ICAM-1/SDF-1 पर लिम्फोसाइट प्रवास LFA-1-मध्यस्थता आसंजन पर निर्भर करता है के रूप में एक विरोधी LFA-1 ligand-अवरुद्ध एंटीबॉडी गंभीर प्रवास रोकता है.

चित्रा 1. सेल ट्रैकिंग टी टी lymphocytes पलायन के पूरे रक्त से अलग है और 6 दिनों के लिए आईएल-2 या आईएल 15 की उपस्थिति में संवर्धित लिम्फोसाइटों. का पालन करें और 10 μg / एमएल ICAM - एक और के साथ लेपित गिलास तली व्यंजन पर विस्थापित करने के लिए अनुमति दी गई 2 μg / एमएल एसडीएफ -1. छवियाँ 30 मिनट के लिए हर 10 सेकंड का अधिग्रहण किया गया. कक्ष प्रत्येक छवि में पहचान की गई और Volocity सॉफ्टवेयर का उपयोग कर समय पर नज़र रखी है. इस फिल्म ~ 15 सुक्ष्ममापी / मिनट की एक वेग में टी lymphocytes के यादृच्छिक प्रवास से पता चलता है.

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मूवी 1. टी lymphocytes पलायन की सेल ट्रैकिंग. टी lymphocytes पूरे रक्त से अलग और की उपस्थिति में संवर्धित आईएल 2 या 6 दिनों के लिए आईएल -15 का पालन करना और गिलास तली व्यंजन 10 μg / एमएल ICAM - 1 और 2 μg / एमएल एसडीएफ -1 के साथ लेपित पर विस्थापित करने के लिए अनुमति दी गई . छवियाँ 30 मिनट के लिए हर 10 सेकंड का अधिग्रहण किया गया. कक्ष प्रत्येक छवि में पहचान की गई और Volocity सॉफ्टवेयर का उपयोग कर समय पर नज़र रखी है. इस फिल्म ~ 15 सुक्ष्ममापी / मिनट की एक वेग में टी lymphocytes के यादृच्छिक प्रवास से पता चलता है.

चित्रा 2 spatiotemporal सेल की स्थिति . प्रत्येक कोशिका के XY निर्देशांक हर बार Volocity सॉफ्टवेयर का उपयोग बिंदु के लिए प्राप्त किया गया.

चित्रा 3. "स्पाइडर वेब साजिश है." XYt का प्रयोग प्रत्येक कक्ष के लिए, 15 कोशिकाओं यादृच्छिक पर चुना गया और मूल में एक आम प्रारंभिक बिंदु के साथ प्लॉट किए जाते हैं निर्देशांक. मकड़ी का जाला भूखंडों की तुलना प्रवास में विभिन्न प्रयोगात्मक शर्तों के बीच मतभेद की एक त्वरित दृश्य चित्रण देता है. टी नियंत्रण की शर्तों के तहत लिम्फोसाइट प्रवास (बाएं पैनल) के लिए और एक विरोधी LFA-1 ligand अवरुद्ध एंटीबॉडी (सही पैनल) की उपस्थिति में भूखंड.

Discussion

इस प्रयोग में, हम प्राथमिक मानव टी lymphocytes की गतिशीलता का विश्लेषण करने के लिए एक सरल प्रणाली पर विवरण प्रदान करते हैं इन विट्रो प्रवास assays में विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं की हरकत में शामिल कई अणु और रास्ते संकेतन की भूमिका काटना इस्तेमाल किया गया है. कुछ महत्वपूर्ण नियंत्रण को ध्यान में रखना जब हमारे प्रोटोकॉल से अपने खुद के प्रयोग डिजाइन शामिल हैं: 1) गैर चिपकने वाला या गैर integrin गोजातीय सीरम (BSA) albumin या पाली एल lysine (पीएलएल) के रूप में चिपकने वाला सब्सट्रेट कोटिंग्स, क्रमशः 2 ) integrin विशिष्ट एंटीबॉडी उपचार अवरुद्ध stimulatory संकेत, जैसे एसडीएफ -1 हमारे प्रोटोकॉल में वर्णित के बिना integrin विशिष्टता, और 3) सह कोटिंग का निर्धारण.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640	GIBCO, by Life Technologies	11875
FBS	Thermo Fisher Scientific, Inc.	SH300070.03
Penicillin-Streptomycin	GIBCO, by Life Technologies	15140
1-Step Polymorphs	Accurate Chemical & Scientific Corporation	AN221725
PHA	Remel, Thermo Fisher Scientific	R30852801
Rec. human IL-2	R&D Systems	202-IL
Rec. human IL-15	R&D Systems	247-IL
Protein G	Sigma-Aldrich	19459
Rec. human ICAM-1/Fc	R&D Systems	720-IC
Rec. human SDF-1	R&D Systems	350-NS