Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Humana T-lymfocyter Isolering, Kultur och analys av migration In Vitro Published: June 1, 2010 doi: 10.3791/2017
Automatic Translation
1, 1
1Center for Vaccine Biology and Immunology, University of Rochester

Summary

T-lymfocyter migrering inträffar under målsökande till lymfoida organ, gå ur kärlen och in i perifera vävnader. Här beskriver vi ett protokoll som kan användas för att analysera T-lymfocyter migration

Abstract

Migreringen av T-lymfocyter innebär självhäftande samspelet mellan integriner cellens yta med ligander uttrycks på andra celler eller extracellulära matrix proteiner. Den exakta Spatiotemporal aktivering av integriner från en låg affinitet stat till en hög affinitet tillstånd vid cellens framkant är viktigt för T-lymfocyter migration

Protocol

1. Isolering av Human T-lymfocyter

  1. Skaffa blod från en frisk donator. Låt blodet svalna till rumstemperatur (~ 30 min) innan du fortsätter till nästa steg.
  2. Försiktigt Pipettera över 3 ml polymorfa rumstemperatur densitetsgradient media i en 8 ml rundbottnad polystyren röret. Försiktigt Tillsätt 3 ml helblod på toppen av polymorfa media. Det är viktigt att undvika att blanda de två reagenser.
  3. Centrifugera rören vid 500 xgi 45 minuter i rumstemperatur.
  4. Efter centrifugeringen har perifera mononukleära blodceller (PBMC) separeras nu från andra blodkomponenter i den översta cellager. Den PBMC lagret visas, uppifrån och ner, som den första grumlig bandet.
  5. Ta försiktigt bort den klara gula färg övre fasen av blod, ovanför PBMC lagret, och sedan använda en P1000 mikropipett att överföra PBMC lager till en 15 ml eller 50 ml koniska rör.
  6. Tvätta PBMC två gånger med PBS, centrifugera celler vid 500 xgi 5 minuter varje gång. Supernatanten blir något grumlig efter varje tvätt.

2. Kultur för mänskliga T-lymfocyter

  1. Med pipett överföra PBMC till en T-75 kultur-kolv i 20 ml RPMI 1640 media som innehåller 10% FBS, 1% penicillin / streptomycin och 1 mikrogram / ml phytohemagglutinin (PHA).
  2. Inkubera vid 37 ° C och 5% CO 2 i minst 1 timme och upp till 24 timmar. Detta steg låter monocyter, som kommer att vara anhängare till kolven ytan, att vara skild från lymfocyter som finns kvar i suspension. Om en kort inkubationstid (1 timme) används i detta steg är det acceptabelt att använda RPMI 1640 media som innehåller 10% FBS och 1% penicillin / streptomycin utan att komplettera med PHA som anges i steg 2,1.
  3. Ta försiktigt bort allt material från kolven, lägga till den i en 50 ml koniska rör och centrifugera vid 500 xg under 5 minuter.
  4. Resuspendera cellpelleten, som nu i första hand innehåller lymfocyter, och överföra celler till en ny T-75 kolven som innehåller 25 ml RPMI 1640 media som innehåller 10% FBS, 1% penicillin / streptomycin och 1 mikrogram / ml PHA.
  5. Inkubera vid 37 ° C under 3 dagar (2 dagar om den initiala inkubering av PBMC var över natten). Efter 24 timmar av tillväxten, kan det vara nödvändigt att lägga till 15-20 ml rent medier och överför till en större T-175-kolv.
  6. Efter 3 dagar, använd en pipett för att ta bort media och suspenderade lymfocyter från kolven och överför till en 50 ml koniska rör. Centrifugera vid 500 xgi 5 minuter.
  7. Resuspendera cellpelleten och cellerna förflyttas till en ny T-75 eller T-175 kolven som innehåller 25 ml (T-75) eller 50 ml (T-175) RPMI 1640 med 10% FBS, 1% penicillin / streptomycin, och 20 ng / ml humant IL-2 eller IL-15.
  8. Väx lymfocyter för 4-7 dagar. Om börjar med en T-75 kolv, kommer kulturen behöver byggas ut och överföras till en T-175-kolv efter 1-2 dagar.

3. In vitro Lymphocyte Migrations-analys

  1. 1 dag innan migreringen analysen, päls ett glas-bottom 0,17 mm skålen med 20 mikrogram / ml Protein A eller G i PBS över natten vid 4 ° C.
  2. Tvätta skålen mycket med PBS.
  3. Immobilisera mänskliga ICAM-1/Fc (10 mikrogram / ml) och mänskliga SDF-1 (2 mikrogram / ml) genom att dessa reagenser i PBS lösning på skålen och inkubera 4 timmar i rumstemperatur.
  4. Förbered T-lymfocyter genom att först bestämma celltätheten i kulturen i T-175-kolv med en hemacytometer. Cirka 2-5 x 10 5 celler bör användas per fat för att uppnå en celltätheten lämplig för migration analys.
  5. Tvätta T-lymfocyter två gånger med PBS och sedan återsuspendera i 1 ml L-15 media som innehåller 1 mg / ml D-glukos.
  6. Tvätta skålen täckt med ICAM-1/Fc och SDF-1 mycket med PBS.
  7. Transfer T-lymfocyter i 1 ml media till skålen och underhålla dem vid 37 ° C.

4. Fånga en bildsekvens Använda NIS Elements

  1. Öppna NIS Elements.
  2. I kamerans inställningar, välj "2x2 binning" som läge för både live-bilder och ta bilder.
  3. Gå till menyn Program och välj Definiera / Kör Experiment.
  4. Välj hur lång tid mellan bilder och den totala längden på bildfångst sekvensen.
  5. Tryck på "Kör" knappen för att börja bildtagning.
  6. Celler kan spåras och migration parametrar (hastighet, längd, deplacement, etc.) kvantifieras med hjälp av en av flera programpaket, inklusive ImageJ, AutoQuant eller Volocity (figur 1).
  7. För att generera ett "spindelnät intrig," det xy-koordinater för varje cell och tidpunkterna samlas (Figur 2) och projiceras på en graf med en gemensam utgångspunkt för varje cell i origo (Figur 3).

5. Representativa resultat

På dag 6 av kultur i närvaro av antingen IL-2 eller IL-15, T-lymfocyterutgör> 98% av celler, som bestäms av positiva CD3 färgning samt positiva CD4-och / eller CD8 färgning. För IL-2 har vi hittat 83% CD4 + celler, 15% CD8 + och <1% CD4 + CD8 + celler. För IL-15 har vi hittat 88% CD4 + celler, 11% CD8 + och <1% CD4 + CD8 + celler. Under T-lymfocyter migration på ICAM-1/SDF-1 substrat uppvisade celler med en hastighet av cirka 15 ìm / min som kan upprätthållas över en 1 timmes tid. T-lymfocyter migration ICAM-1/SDF-1 är beroende av LFA-1-medierad vidhäftning som en anti-LFA-1 ligand-blockerande antikroppar allvarligt hämmar migrationen.

Figur 1
Figur 1. Cell spårning av flyttande T-lymfocyter. T-lymfocyter som isolerats från helblod och odlade i närvaro av IL-2 eller IL-15 för 6 dagar fick fäste och migrera på glas botten rätter belagd med 10 mikrogram / ​​ml ICAM-1 och 2 mikrogram / ml SDF-1. Bilder förvärvades var 10 sekunder i 30 minuter. Celler identifierades i varje bild och spåras över tid med hjälp av Volocity programvara. Denna film visar slumpmässiga migration av T-lymfocyter med en hastighet av ~ 15 ìm / min.

Klicka här för att se videon.
Film 1. Cell spårning av flyttande T-lymfocyter. T-lymfocyter som isolerats från helblod och odlade i närvaro av IL-2 eller IL-15 för 6 dagar fick fäste och migrera på glas botten rätter belagd med 10 mikrogram / ml ICAM-1 och 2 mikrogram / ml SDF-1 . Bilder förvärvades var 10 sekunder i 30 minuter. Celler identifierades i varje bild och spåras över tid med hjälp av Volocity programvara. Denna film visar slumpmässiga migration av T-lymfocyter med en hastighet av ~ 15 ìm / min.

Figur 2
Figur 2. Spatiotemporal cell position. XY-koordinaterna för varje cell erhölls för varje tidpunkt med hjälp av Volocity programvara.

Figur 3
Figur 3. "Spider web tomt." Använda XYt koordinaterna för varje cell, var 15 celler slumpmässigt vald ritas med en gemensam utgångspunkt i origo. Jämföra tomter spindelnät ger en snabb visuell skildring av skillnader i migration mellan olika experimentella förhållanden. Tomt till T-lymfocyter migration under kontroll förhållanden (till vänster) och i närvaro av en anti-LFA-1 ligand-blockerande antikropp (högra panelen).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I detta experiment ger vi information om ett enkelt system för att analysera motilitet primära humana T-lymfocyter. In vitro-migration-analyser har använts för att dissekera de roller många molekyler och signalvägar involverade i rörelseorganen av olika celltyper. Vissa kritiska för att hålla i åtanke när du utformar dina egna experiment från våra protokoll är: 1) Icke-självhäftande eller icke-integrin självhäftande substrat beläggningar, såsom bovint serumalbumin (BSA) eller poly-L lysin (PLL) respektive 2 ) integrin-specifika blockerande antikroppar behandling för att avgöra integrin specificitet, och 3) samarbete beläggning utan stimulerande signal, som SDF-1 som beskrivs i våra protokoll.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

Projektet stöddes av National Institutes of Health bidrag HL087088 (MK) och HL18208 (MK).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 GIBCO, by Life Technologies 11875
FBS Thermo Fisher Scientific, Inc. SH300070.03
Penicillin-Streptomycin GIBCO, by Life Technologies 15140
1-Step Polymorphs Accurate Chemical & Scientific Corporation AN221725
PHA Remel, Thermo Fisher Scientific R30852801
Rec. human IL-2 R&D Systems 202-IL
Rec. human IL-15 R&D Systems 247-IL
Protein G Sigma-Aldrich 19459
Rec. human ICAM-1/Fc R&D Systems 720-IC
Rec. human SDF-1 R&D Systems 350-NS

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hyun, Y. M., Chung, H. L., McGrath, J. L., Waugh, R. E., Kim, M. Activated integrin VLA-4 localizes to the lamellipodia and mediates t cell migration on VCAM-1. J Immunol. 183, 359-369 (2009).
  2. Morin, N. A., Oakes, P. W., Hyun, Y. M., Lee, D., Chin, Y. E., King, M. R., Springer, T. A., Shimaoka, M., Tang, J. X., Reichner, J. S., Kim, M. Nonmuscle myosin heavy chain IIA mediates integrin LFA-1 de-adhesion during T lymphocyte migration. The Journal of experimental medicine. 205, 195-205 (2008).
  3. Hyun, Y. M., Lefort, C. T., Kim, M. Leukocyte integrins and their ligand interactions. Immunologic research. , (2009).

Tags

Immunologi 40 T-lymfocyter migration Integrin LFA-1 ICAM-1 kemokinreceptorantagonist
Humana T-lymfocyter Isolering, Kultur och analys av migration<em> In Vitro</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lefort, C. T., Kim, M. Human T… More

Lefort, C. T., Kim, M. Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro. J. Vis. Exp. (40), e2017, doi:10.3791/2017 (2010).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video
Waiting X
Simple Hit Counter