Summary
T淋巴细胞的迁移过程中出现归巢淋巴器官，从血管中退出，进入周围组织。在这里，我们描述了一个可以用来分析T淋巴细胞迁移的协议
Abstract
T淋巴细胞的迁移涉及到与其他细胞或细胞外基质蛋白表达的配体的细胞表面整合的粘合剂的相互作用。从低亲和力状态激活在细胞前沿的高亲和力状态的精确时空的整合是很重要的T淋巴细胞迁移
Protocol
1。人T淋巴细胞的分离
- 人体血液中获得一个健康的捐赠者。让血液冷却至室温（约30分钟），然后再继续下一步。
- 到8 ml圆底聚苯乙烯管轻轻吸液管3毫升室温变形密度梯度介质。轻轻地加入3毫升全血的变形媒体上。重要的是要避免两种试剂混合。
- 500在室温下45分钟XG的离心管。
- 外周血单个核细胞（PBMC）的离心后，现在已经从其他血液成分分离到顶部的细胞层。外周血单个核细胞层的出现，从上往下，作为第一个阴天乐队。
- 小心取出的血液明显的黄色上相以上的外周血单个核细胞层，然后使用P1000的微量外周血单个核细胞层转移到15 mL或50 mL锥形管。
- 用PBS洗两次PBMC的细胞，每次5分钟，离心500 XG。每次冲洗后，上清液将会有所阴天。
2。文化对人T淋巴细胞
- 使用吸管，在20毫升含10％胎牛血清的RPMI 1640媒体传输到T - 75培养瓶中的外周血单个核细胞，青霉素/链霉素，1％和1μg/ mL的植物血凝素（PHA）。
- 在37 ° C和5％CO 2至少1小时，最长为24小时。这一步使单核细胞，将附着在烧瓶表面，仍然处于悬浮状态的淋巴细胞分离。如果在这一步一个潜伏期短（1小时），它是可以接受的RPMI 1640培养液含10％胎牛血清和1％的青霉素/链霉素2.1步中指定的补充没有与PHA的媒体。
- 小心取出所有的媒体都从瓶中，加入50 mL锥形管，并在500 XG离心5分钟。
- 悬浮细胞沉淀，目前主要包含淋巴细胞，并转移到一个新的T - 75烧瓶中含有25毫升的RPMI 1640介质含10％胎牛血清的细胞，1％青霉素/链霉素，1微克/毫升PHA的。
- 在37 ° C孵育3天，如果最初的PBMC培养过夜（2天）。经过24小时的增长，它可能需要添加15-20毫升新鲜媒体，并转移到一个较大的T - 175烧瓶。
- 经过3天，用吸管取出烧瓶并转移至50 mL锥形管媒体和暂停淋巴细胞。在500 XG离心5分钟。
- 重悬细胞沉淀和转移细胞到一个新的T - 75或T - 175烧瓶中含有25毫升（T - 75）或50毫升（T - 175）的RPMI 1640含10％胎牛血清，1％青霉素/链霉素和20 ng / mL的人IL - 2或IL - 15。
- 长为4-7天的淋巴细胞。如果与一个T - 75烧瓶开始，文化需要扩大和转移到了T - 175烧瓶后1-2天。
（3） 在体外淋巴细胞迁移实验
- 迁移实验前1天，外套一个玻璃底的0.17毫米与20μg/ mL的蛋白A或摹在PBS过夜4盘° C。
- 广泛的菜洗净，用PBS。
- 固定人类ICAM-1/Fc（10微克/毫升）和人力SDF - 1的PBS液中加入这些试剂的菜，并在室温下孵育4个小时（2微克/毫升）。
- 准备首先确定的文化中的T - 175使用一个hemacytometer烧瓶细胞密度T淋巴细胞。应使用约2-5 × 10 5细胞，每道菜，实现了细胞密度适当的迁移分析。
- 两次用PBS洗T淋巴细胞，然后悬浮在1毫升含有1毫克/毫升D -葡萄糖的L - 15媒体。
- 涂有ICAM-1/Fc和SDF - 1广泛用PBS洗净的菜。
- T淋巴细胞在1毫升媒体传输的菜，和他们保持在37 ° C。
4。使用NIS Elements软件捕获图像序列
- 打开NIS Elements软件。
- 在相机设置菜单中，选择“2x2的分级”，实时成像和图像捕捉模式。
- 转到“应用程序”菜单中选择定义/运行实验。
- 选择图像和图像采集序列的总长度之间的时间长度。
- 按“运行”按钮开始图像采集。
- 细胞可以跟踪和迁移参数（速度，路径长度，位移等）的量化使用几个软件包，包括ImageJ，AutoQuant或Volocity（图1）。
- 要生成一个“蜘蛛网情节，”XY坐标，为每一个细胞和时间点收集（图2），并投射到一个共同的出发点，在每个细胞的起源（图3）图。
5。代表性的成果
文化6天或IL - 2或IL - 15，T淋巴细胞的存在> 98％的细胞，积极CD3 +染色，以及积极的CD4 +和/或CD8染色确定。对于IL - 2，我们发现83％的CD4 +细胞，15％CD8 +和<1％的CD4 + CD8 +细胞。对于IL - 15，我们发现88％的CD4 +细胞，11％，CD8 +和<1％的CD4 + CD8 +细胞。细胞在T淋巴细胞迁移ICAM-1/SDF-1基板上，展出了约15微米/分钟，可超过1个小时的时间内持续的速度。 ICAM-1/SDF-1 T对淋巴细胞迁移依赖于LFA - 1介导的粘附，作为一种抗LFA - 1配体阻断抗体严重抑制迁移。
图1。细胞跟踪从全血中分离，并在6天的IL - 2或IL - 15培养的T淋巴细胞，T淋巴细胞的迁移。坚持和迁移10μg/ mL的ICAM - 1和镀膜玻璃底菜2μg/ mL的SDF - 1。图片被收购30分钟，每10秒。每幅图像的细胞进行鉴定和跟踪时间超过使用Volocity软件。这部影片展示了T淋巴细胞〜15微米/分钟的速度的随机迁移。
点击这里看视频。
电影1。细胞T淋巴细胞的迁移跟踪。从全血中分离和培养中存在的的T淋巴细胞IL - 2或6天的IL - 15是坚持和迁移涂有10微克/毫升ICAM - 1和2微克/毫升SDF - 1的玻璃底船菜。图片被收购30分钟，每10秒。每幅图像的细胞进行鉴定和跟踪时间超过使用Volocity软件。这部影片展示了T淋巴细胞〜15微米/分钟的速度的随机迁移。
图2。时空单元格的位置。每次使用Volocity软件获得的每一个细胞的XY坐标。
图3。“蛛网的阴谋。”使用XYt每一个细胞，随机选择了15个细胞，并绘制一个共同的起点在原点的坐标。蛛网图相比较，给出了一个移民之间的差异不同实验条件下的快速可视化的描述。图解T淋巴细胞迁移控制的条件下（左图）和抗LFA - 1的配体阻断抗体（右图）的存在。
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Discussion
在这个实验中，我们提供了一个简单的系统来分析初级人类T淋巴细胞的活力细节。体外迁移实验已用于解剖的许多分子和参与各种细胞类型的运动的信号转导通路的作用。要记住，从我们的协议设计自己的实验时，一些关键的控制包括：1）非粘性或不整合胶粘剂基材，如牛血清白蛋白（BSA）或聚左旋赖氨酸（PLL），涂料，分别为2 ）整合特定的封闭抗体治疗，无刺激信号，如SDF - 1在我们的协议，确定整合的特殊性，3）合作涂层。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这个项目是由美国国立卫生赠款HL087088（MK）和HL18208（MK）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 11875 | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH300070.03 | |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| 1-Step Polymorphs | Accurate Chemical & Scientific Corporation | AN221725 | |
| PHA | Remel, Thermo Fisher Scientific | R30852801 | |
| Rec. human IL-2 | R&D Systems | 202-IL | |
| Rec. human IL-15 | R&D Systems | 247-IL | |
| Protein G | Sigma-Aldrich | 19459 | |
| Rec. human ICAM-1/Fc | R&D Systems | 720-IC | |
| Rec. human SDF-1 | R&D Systems | 350-NS |
References
- Hyun, Y. M., Chung, H. L., McGrath, J. L., Waugh, R. E., Kim, M. Activated integrin VLA-4 localizes to the lamellipodia and mediates t cell migration on VCAM-1. J Immunol. 183, 359-369 (2009).
- Morin, N. A., Oakes, P. W., Hyun, Y. M., Lee, D., Chin, Y. E., King, M. R., Springer, T. A., Shimaoka, M., Tang, J. X., Reichner, J. S., Kim, M. Nonmuscle myosin heavy chain IIA mediates integrin LFA-1 de-adhesion during T lymphocyte migration. The Journal of experimental medicine. 205, 195-205 (2008).
- Hyun, Y. M., Lefort, C. T., Kim, M. Leukocyte integrins and their ligand interactions. Immunologic research. , (2009).
