Summary
本协议描述了如何染色质免疫沉淀（ChIP）是用来研究的动态改变，调节信号转导通路诱导转录的染色质模板。
Abstract
在应对各种胞外配体时，STAT（信号转导和转录激活因子）转录因子迅速招募来，他们是由在一个单一的酪氨酸残基 1的磷酸化激活的细胞表面受体在细胞质中的潜伏状态。然后，他们二聚体，并转运到细胞核驱动的靶基因的转录，影响生长，分化，动态平衡和免疫反应。毫不奇怪，因为他们在正常细胞过程中的广泛参与，STAT的功能失调导致人类疾病， 特别是2和3的癌症自身免疫性疾病。
它是公认的，是通过改变转录调节染色质模板 4,5 。这些变化包括ATP依赖的复合物，以及共价组蛋白修饰和DNA甲基化6的活动。由于基因表达激活的STAT是迅速而短暂的，它需要在STAT相关的基因位点的调节染色质模板的具体机制。要定义这些机制中，我们描述的组蛋白修饰和酶活动产生响应STAT信号的基因位点。此协议介绍，STAT信号激活基因表达染色的研究提供宝贵的一个方法，是染色质免疫沉淀。
Protocol
规划
前一天，一个芯片实验计划，使足够数量的，应该是培养细胞。假设每个芯片检测将需要〜1-1.5 × 10 7细胞。始终做负球蛋白（IgG）和积极的（潘组蛋白抗体）控制和重复实验。
提示 -对于2FTGH细胞，每个芯片的检测要求在80％汇合约15 cm组织培养皿中。
第1部分：准备染色质和执行系统
- 取出培养基，诱导细胞20毫升10％的宇宙小牛血清（CCS）/ 5毫微克/毫升含有γ-干扰素的DMEM所需的时间。替换20毫升10％CCS / DMEM培养液，以及对非诱导板的媒体。
- 在通风橱中，添加540μL37％的甲醛20毫升媒体15 cm培养皿中（终浓度1％）。
提示 -倾斜板，然后添加甲醛的介质池-岩石板扩散均匀。 - 允许继续在室温下10分钟的交联。
- 添加甘氨酸0.125米决赛浓度停止交联。
- 真空吸媒体和洗细胞一次用10 mL冰冷的磷酸盐缓冲液（PBS）。
- 收集细胞与细胞刮刀〜7毫升PBS，并结合细胞（6板），共收治50毫升锥形管冰相同。
- 离心机（美国贝克曼Coutler Allegra的12 - R离心机）在1800 RPM在4 ° C和5分钟吸的PBS。
提示 -捕捉冻结的细胞沉淀，如果停在这里，并储存于-80 ° C 。 - 重悬细胞沉淀在4毫升膨胀的缓冲液（25毫米HEPES pH值7.8，1.5毫米氯化镁 2，氯化钾10毫米，0.1％NP40。添加1毫米DTT，完整的蛋白酶抑制剂和寒意上冰前使用），并转移至15 mL锥形管。
提示 -这种膨胀的缓冲液是适合6板池（〜6-9 x 10 7细胞） 。或多或少的缓冲区可能改变douncing效率。 - 孵育10分钟，在冰上的细胞悬液。
- 转让暂停一个预冷15毫升douncer（惠顿）和dounce杵答：20杆
- 转让dounced细胞恢复到15 mL锥形管上冰。
- 5分钟2500转的离心机在4 ° C，弃上清。
- 重悬在3毫升的核颗粒（约200μL6板）超声缓冲液（15颗粒卷）（的50 mM HEPES pH值7.9，氯化钠140毫米，1毫米EDTA，1％TRITON X - 100，0.1％去氧胆酸钠， 0.1％SDS在冰上添加完整的蛋白酶抑制剂和寒冷，在使用前）。
提示 -此超声缓冲液是适合6板池（〜6-9 × 10 7细胞）。或多或少的缓冲区可能会改变的超声效率。 - 超声对冰核停牌10个周期（20秒on/40 8秒/关闭幅度设置）使用一个Misonix Sonicator 3000配备的微尖。这通常会导致染色质片段，平均200-1000个基点大小。
提示 -由于sonicators会有所不同，超声效率，必须凭经验确定。要做到这一点，前超声和超声循环后，每个分装20μL。在65 ° C加热4小时，这些样品。添加DNA上样缓冲液，运行一个标准的1％琼脂糖/ TBE凝胶，以可视化的DNA片段。） - 转让超声20分钟的材料SS34离心管，离心4 °彗星在SS34转子13000 RPM（Sorvall RC6加离心机）颗粒通常是少量的细胞碎片。
- 小心将上清转移至15 mL锥形管上冰。
- 加入360μL的鲑鱼精子DNA /蛋白质A或G琼脂糖珠浆，在4 ° C摇晃至少30分钟的预清除。
提示 -这一步降低噪音试验从非特异性结合事件发生。 - 在4 ° C离心5分钟沉淀琼脂糖珠在1000 rpm。
- 传送前清除上清另一个15毫升锥形管冰。
- 测量前清除染色的A260单位和超声缓冲区的音量调整到四（4）（0.2 mg / mL的假设1单位= 0.050毫克/毫升A260 A260单位）
提示 -要衡量A260单位，稀释，在190μLDDW 10μL预先清除染色;空白分光光度计10μL超声缓冲液190μL，DDW。 - 保存75μL的染色质（4 A260单位）作为输入采样并存储在20 ° C，直到准备反向交联。
提示 -这一步是进行数据分析的关键。不要忽视输入等分。 - 分装1.7 ml离心管上我准备染色CE为1毫升等分。
提示 -如果停在这里，单元冻结干冰和存储的准备染色，在-80 ° C。注：存储染色，可降解，生产不到最佳的效果，这样就可以避免如果可能的话。 - 添加的芯片级抗体诱导和未诱导的样品重复设置。加入IgG抗体阴性和阳性对照，以诱导和未诱导的样品集（2微克）和泛组蛋白H3抗体（15μL）。
提示 -使用的抗体量，必须凭经验确定或建议金额的供应商的产品负债表。一个芯片级的抗体，通常为1-2微克效果很好。必须确定适当的音量经验，提供血清抗体。 - 岩石在一夜之间所有的管子在4 ° C。
第2部分：COLLECT免疫复合物
- 加入60μL鲑鱼精DNA /蛋白A或蛋白G琼脂糖珠浆所有的管子。
提示使用小鼠单克隆抗体，多克隆抗体和G蛋白的蛋白质。 - 在4 ° C的岩石，至少60分钟。
- 颗粒的免疫复合物（琼脂糖珠）microfuging在2000转，轻轻地在4 ° C时3分钟。
- 吸出上清液。
- 洗净的免疫复合物，用1毫升每10分钟以下洗净缓冲器摇摆在4 ° C。在4℃离心3分钟在2000转每洗，吸上清彗星之间。让冷冻样品在冰上。加入PMSF在使用前。
- 低盐清洗 - 0.1％SDS，1％TRITON X - 100，2毫米EDTA，20毫米，150毫米氯化钠，pH值8.0的Tris - CL，1毫米PMSF
- 高盐液 - 0.1％SDS，1％TRITON X - 100，2毫米EDTA，20毫米，pH值8.0的Tris - CL 500毫米氯化钠，1毫米PMSF
- 氯化锂洗净 - 氯化锂0.25米，1％NP - 40，1％去氧胆酸钠，1 mM的EDTA，10毫米的Tris - CL，pH值8.0，1毫米PMSF
- 特洗衣 - 两个TE缓冲液-10毫米的Tris - CL，pH值8.0，1 mM的EDTA，PMSF 1毫米清洗
- 删除最后的TE缓冲液洗珠，加入500μl洗脱缓冲液（50毫米的Tris - CL，pH值8.0，10 mM的EDTA，1％SDS）。
提示 -洗脱缓冲液应新鲜准备。 - 涡旋混合30分钟琼脂糖珠，洗脱缓冲液和发热量，在65 ° C。
提示 -涡每管至少在这30分钟内每10分钟。 - 离心30秒，在2000转和洗脱液转移到一个新的离心管。
提示 -在洗脱，解冻您的输入样本，并加入500μl洗脱缓冲液，以每一个。这些样本包括前进中的所有步骤。 - 5 M氯化钠加入终浓度为200毫米的所有样品和涡。
- 在65 ° C孵育过夜（或至少4个小时）。
第3部分：净化ChIP'd和输入的DNA
- 所有样品离心30秒收集凝结盖。
- 1μL核糖核酸酶A（10 U /μL）添加到每个管，室温孵育15分钟。
- 加入10μL，0.5 M EDTA，40μL0.5 M Tris - CL的pH值6.5，2μL蛋白酶K（10毫克/毫升）和孵育在45 ° C为60分钟。提示准备掌握了这些试剂混合，并添加52μL，每管。
- 酚/氯仿/异戊醇提取物和氯仿/异戊醇提取样品。
- 加入2μL的糖原（25微克/μL）和0.1卷3M钠醋酸pH值5.2和旋涡。
- 添加2.5 100％的乙醇和旋涡卷。
- 孵育在20 ° C过夜。
第4部分：净化ChIP'd及输入的DNA续
- 离心样品最低为20分钟，在13000转4 ° C至沉淀的DNA /糖原颗粒。
- 1毫升70％的乙醇清洗DNA /糖原颗粒。
- 空气干燥颗粒在DNA SAVANT高速真空离心机或快速干燥。
提示 -不要过度干燥的DNA。 - 重悬在200μLTE缓冲液中的DNA /糖原颗粒。
- DNA（1μL）通过实时PCR定量。商店剩余的DNA在20 ° C。
提示 -使用超过1μL的DNA能抑制实时PCR反应，如此规模的谨慎。
第5部分：代表性的结果：
芯片和输入的DNA样本进行量化实时PCR 7,8使用特定利益的基因位点的引物（应用生物系统公司7500快速实时PCR系统）。目标基因组序列已知的富集或缺乏在被检测的组蛋白修饰的引物可用于以及作为阳性和阴性对照。数据作为输入％。芯片程序应完全řepeated与三个生物复制，以确保报道组蛋白修饰的变化有统计学意义。
使用实时PCR定量的DNA，包括引物设计，PCR的效率，并适当的方法来计算％的输入和规范化程序时，有几个重要的问题需要考虑。在分析跨基因组蛋白修饰入住，各引物对PCR效率必须一致。实时PCR系统制造商可以提供必要的信息和培训。
图1显示了代表染色质免疫沉淀在STAT1的IRF1基因的激活，引发由干扰素-γ 。
图1。 IRF1基因在STAT1的激活STAT1，RNA聚合酶II和H3K36me3占用是动态的。 （A，B，C）的芯片与α- H3K36me3，α- STAT1和α-波尔染色质II 2FTGH细胞收集诱导IFN -γ为30分钟（红色方块），1.5小时（蓝色圆圈），5小时（绿色三角形）或非诱导（黑钻石）。抗体是阴性对照组（灰色跨越），（四 ）泛H3是积极的控制和显示横跨在诱导（蓝色圆圈）位点的组蛋白占用和非诱导条件（黑钻石）。周围-5 BP下跌是由于核小体耗尽是在转录起始位点的发现。
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Discussion
芯片协议概述已成功地应用于实验室检测超过20种不同的组蛋白修饰。此外，我们有特点的转录因子的入住变化，组蛋白修饰酶，蛋白质识别组蛋白修饰和RNA聚合酶II的转录机器，几个干扰素γ诱导的基因。我们也使用的过程，刻画在一个癌症干细胞的分化10组蛋白修饰的变化。
芯片的数据的质量最终取决于所使用的抗体的有效性和抗体之间有很大差别。故障芯片的修改，因此，不能被解释的意思，表示修改不存在。此外，在芯片实验中观察到一个特别修改的变化可能只是反映了一个额外的组蛋白修饰在附近的残留物造成的抗体识别的抗原表位的变化。因此，芯片结果必须验证方法将在组蛋白修饰与观测到的变化到生物的结果。当做到这一点，芯片是一个功能强大的方法来研究染色质基因表达的调控机制，有助于。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是由弗吉尼亚大学，弗吉尼亚大学癌症中心和托马斯F和凯特米勒Jeffress纪念信托基金的支持。我们感谢詹姆斯E.达内尔实验室（美国洛克菲勒大学的）罗伯特罗斯实验室（Fordham大学）细胞株。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37% Formaldehyde | Fisher Scientific | BP531-500 | |
| Chloroform/Isoamyl alcohol | Acros Organics | AC32715-5000 | |
| Complete Mini Protease Inhibitors | Roche Group | 1836153 | |
| Cosmic Calf Serum | Hyclone | SH30087.04N | |
| DMEM | Hyclone | SH30243 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP118-500 | |
| Ethanol | Pharmco Products, Inc. | zp1110EP | |
| Glycine | Roche Group | 100149 | |
| Glycogen | Roche Group | 901393 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3784 | |
| IFN-gamma | R&D Systems | 285-IF-100 | |
| IgG | Jackson ImmunoResearch | 109-005-003 | |
| KCl | MP Biomedicals | ||
| LiCl | Sigma-Aldrich | L4408 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Sodium Acetate | Fisher Scientific | BP333-500 | |
| Deoxycholic Acid Sodium Salt | Fisher Scientific | BP349-100 | |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| NP40 | US Biological | N3500 | |
| Anti-Histone H3, CT, pan | EMD Millipore | 07-690 | |
| Phenol/chloroform/isoamyl | Fisher Scientific | 108-95-2 | |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| PMSF | EMD Millipore | 50-230-0316 | |
| Proteinase K | 5 PRIME | 2500140 | |
| RNAse A | 5 PRIME | 2500130 | |
| Salmon Sperm DNA/Protein A Agarose | EMD Millipore | 16-157 | |
| Salmon Sperm DNA/Protein G Agaorse | EMD Millipore | 16-201 | |
| SDS | Fisher Scientific | BP166-500 | |
| Tris-Cl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Triton X-100 | Acros Organics | 327372500 | |
| Anti-K36me3 | Abcam | ab9050 | |
| Anti-STAT1 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-345X | |
| Anti-RNA Polymerase II | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-899 |
References
- Levy, D., Darnell, J. E. Signalling: Stats: transcriptional control and biological impact. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3, 651-662 (2002).
- Bromberg, J., Darnell, J. E. Jr The role of STATs in transcriptional control and their impact on cellular function. Oncogene. 19, 2468-2473 (2000).
- Hu, X., Ivashkiv, L. B. Cross-regulation of signaling pathways by interferon-gamma: implications for immune responses and autoimmune diseases. Immunity. 31, 539-550 (2009).
- Campos, E. I., Reinberg, D.
- Kouzarides, T.
- Jenuwein, T., Allis, C. D.
- Wittwer, C. T., Herrmann, M. G., Moss, A. A., Rasmussen, R. P. Continuous fluorescence monitoring of rapid cycle DNA amplification. Biotechniques. 22 (130-131), 134-138 (1997).
- Higuchi, R., Dollinger, G., Walsh, P. S., Griffith, R. Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences. Biotechnology (N Y). 10, 413-417 (1992).
- Kroger, A., Koster, M., Schroeder, K., Hauser, H., Mueller, P. P.
- Ross, R. A., Spengler, B. A.
