Summary
Detta protokoll beskriver hur kromatin immunoprecipitation (chip) används för att studera dynamiska förändringar i kromatin mall som reglerar transkription inducerad av en signaltransduktion väg.
Abstract
Som svar på en mängd extracellulär ligander transkriptionsfaktorer STAT (signal givare och aktivator av transkription) snabbt rekryteras från sitt latenta tillstånd i cytoplasman till receptorer på cellens yta där de aktiveras av fosforylering på en enda tyrosin rester 1. De sedan dimerize och translocate till kärnan för att driva transkriptionen av mål gener, som påverkar tillväxt, differentiering, homeostas och immunförsvaret. Inte överraskande, med tanke på deras omfattande engagemang i cellens normala processer bidrar oregelbundenhet i STAT funktion till mänskliga sjukdomar, särskilt cancer 2 och autoimmuna sjukdomar 3.
Det är välkänt att transkription styrs av förändringar i kromatin mallen 4,5. Dessa förändringar omfattar verksamheten i ATP-beroende komplex, liksom kovalenta histon modifieringar och DNA-metylering 6. Eftersom STAT aktivering av genuttryck är både snabba och övergående, det kräver särskilda mekanismer för modulerande kromatinet mall på STAT-beroende genen loci. För att definiera dessa mekanismer, karakteriserar vi histon ändringar och den enzymatiska aktiviteter som genererar dem i gen-loci som svarar på STAT signalering. Detta protokoll beskriver kromatin immunoprecipitation, en metod som är värdefull för studier av STAT signalering till kromatin i aktiverade genuttryck.
Protocol
PLANERING
Dagen innan en ChIP experiment planeras, bör cellerna odlas så att ett tillräckligt antal finns tillgänglig. Antag att varje chip analysen kräver ~ 1-1,5 x 10 7 celler. Alltid planerar att göra både det negativa (IgG) och positiva (PAN histon antikroppar) kontroller och duplicera experiment.
Tips - För 2FTGH celler, kräver varje chip analys ungefär en 15 cm parabolantenn vävnadsodling på 80% confluency.
DEL 1: Förbered kromatin och utföra ChIP
- Ta odlingsmedia och framkalla celler för den tid som behövs med 20 ml 10% kosmisk kalvserum (CCS) / DMEM innehåller IFN-gamma vid 5 ng / ml. Byt ut media på den uninduced tallrikar med 20 ml 10% CCS / DMEM också.
- I ett dragskåp, lägg till 540 mikroliter 37% formaldehyd till 20 ml av media (1% slutlig koncentration) i 15 cm skålen.
Tips - Luta plattan och tillsätt formaldehyd till media poolen - och sedan klippa plåt för att sprida det jämnt. - Låt crosslinking fortsätta i 10 minuter vid rumstemperatur.
- Lägg glycin till 0,125 M slutlig koncentration för att stoppa crosslinking.
- Dammsug aspirera media och tvätta cellerna en gång med 10 ml iskall fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Samla celler med en cell skrapa i ~ 7 mL PBS och kombinera celler (från 6 plattor) som behandlades på samma sätt i 50 ml koniska rör på is.
- Centrifug (Beckman Coutler Allegra 12-R Centrifugera) vid 1800 rpm vid 4 ° C i 5 minuter och aspirera PBS.
Tips - Snap frysa cellpelleten om att stanna här och förvara vid -80 ° C. - Resuspendera cellpelleten i 4 ml Svullnad buffert (25 mm HEPES pH 7,8, 1,5 mM MgCl 2, 10 mm KCl, 0,1% NP40. Tillsätt 1 mM DTT, Komplett proteashämmare och chill på is före användning) och överför till en 15 ml koniska rör.
Tips - Denna svullnad buffert volym är lämpligt för en 6 tallrik sammanslagning (~ 6-9 x 10 7 celler). Mer eller mindre buffert kan ändra douncing effektivitet. - Inkubera cellsuspension på is i 10 minuter.
- Överför suspensionen till ett i förväg kylt 15 mL douncer (Wheaton) och dounce 20 slag med mortelstöt A.
- Överför dounced celler tillbaka till ett 15 ml koniskt rör på is.
- Centrifugera vid 2500 rpm i 5 minuter vid 4 ° C och kassera supernatanten.
- Resuspendera nukleära pellet (~ 200 mikroliter från 6 plattor) i 3 ml (15 pellets volymer) av ultraljudsbehandling Buffer (50 mm HEPES pH 7,9, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 0,1% Natrium ingår i detta vaccin, 0,1% SDS. Lägg Komplett proteashämmare och chill på is precis före användning).
Tips - Denna ultraljudsbehandling buffert volym är lämpligt för en 6 tallrik sammanslagning (~ 6-9 x 10 7 celler). Mer eller mindre buffert kan ändra sonication effektivitet. - Sonikera kärnor fjädring på is i 10 cykler (20 sekunder on/40 sekunder från / amplitud inställning av 8) med hjälp av en Misonix Sonicator 3000 utrustad med microtip. Detta resulterar normalt i kromatin fragment genomsnitt 200-1000 bps i storlek.
Tips - Eftersom sonicators varierar, måste sonication verkningsgrad bestämmas empiriskt. För att göra detta, ta alikvoter av 20 mikroliter före ultraljudsbehandling och efter varje sonication cykel. Värm dessa prover vid 65 ° C i 4 timmar. Lägg buffert DNA lastning och kör en vanlig 1% agaros / TBE-gel för att visualisera DNA-fragment.) - Överföring sonicated material till en SS34 centrifugrör och centrifugera i 20 minuter vid 4 ° C på 13 tusen rpm i en SS34 rotorn (Sorvall RC6 Plus Centrifugera) till pellets vad som brukar en liten mängd celler skräp.
- Försiktigt Överför supernatanten till ett 15 ml koniskt rör på is.
- Pre-klar genom att tillsätta 360 mikroliter Lax spermiens DNA / Protein A eller G agaros pärlor slurry och gunga vid 4 ° C i minst 30 minuter.
Tips - Detta steg minskar bullret i analysen som uppstår ur icke-specifik bindning händelser. - Centrifugera vid 1000 rpm vid 4 ° C i 5 minuter till pellets agarosen pärlor.
- Överföring före rensas supernatanten till en annan 15 ml koniska rör på is.
- Mät A260 enheter före rensas kromatin och justera volymen med sonication buffert till fyra (4) A260 enheter (0,2 mg / ml om 1 A260 enhet = 0,050 mg / ml)
Tips - För att mäta A260 enheter, späd 10 mikroliter av pre-rensas kromatin i 190 mikroliter DDW, tom spektrofotometer med 10 mikroliter ultraljudsbehandling buffert i 190 mikroliter DDW. - Spara 75 mikroliter av kromatin (vid 4 A260 enheter) som ingång Sample och förvara vid 20 ° C tills de ska vända antipyridinantikropp.
Tips - Detta steg är avgörande för dataanalys. Försumma inte att ta in delmängd. - Alikvotera det förberedda kromatinet till 1,7 rören ml mikrofugrör om jagce som 1 mL alikvoter.
Tips - Om stopp här, knäppa frysa beredd kromatinet på torris och förvaras vid -80 ° C. OBS: förvaras kromatin kan försämra, producerar mindre än optimala resultat, så undvik om möjligt. - Lägg till Chip-klass antikroppar mot den inducerade och uninduced prover sätter i två exemplar. Lägg IgG (2 mikrog) och Pan Histon H3 antikropp (15 mikroliter) som negativa och positiva kontroller för att framkallas och uninduced prover set.
Tips - måste Mängden antikroppar använda bestäms empiriskt eller se leverantörens produktblad för föreslagna belopp. Normalt 1-2 mikrogram av ett chip-grade antikroppar fungerar bra. Lämplig volym måste bestämmas empiriskt för antikroppar som levereras som serum. - Rock alla rören över natten vid 4 ° C.
DEL 2: Samla IMMUNOCOMPLEXES
- Tillsätt 60 mikroliter av lax spermiens DNA / Protein A eller protein G agaros pärlor slammet till alla rör.
Tips Använd Protein A för kanin polyklonala antikroppar och Protein G för mus monoklonala antikroppar. - Rock vid 4 ° C i minst 60 minuter.
- Pelletera immunocomplexes (agaros pärlor) av microfuging försiktigt vid 2000 rpm vid 4 ° C i 3 minuter.
- Aspirera supernatanten.
- Tvätta immunocomplexes med 1 ml vardera av följande Wash buffertar för 10 minuter med gungande vid 4 ° C. Mikrofugrör i 3 minuter vid 2000 rpm vid 4 ° C mellan varje tvätt och aspirera supernatanten. Håll prover kylda på is. Lägg PMSF strax före användning.
- Låg Salt Tvätt - 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-Cl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mm PMSF
- Hög Salt Tvätt - 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-Cl, pH 8,0, 500 mM NaCl, 1 mm PMSF
- LiCl Wash - 0,25 M LiCl, 1% NP-40, 1% Natrium ingår i detta vaccin, 1 mM EDTA, 10 mM Tris-Cl, pH 8,0, 1 mm PMSF
- TE Wash - TVÅ Tvättar med TE-buffert -10 mM Tris-Cl, pH 8,0, 1 mM EDTA, 1 mm PMSF
- Ta bort den sista TE buffert tvätta och till pärlor, lägga 500 mikroliter Elution buffert (50 mM Tris-Cl, pH 8,0, 10 mM EDTA, 1% SDS).
Tips - elueringen Buffer ska beredas. - Vortex att blanda agaros pärlor i Elution Buffert och värme i 30 minuter vid 65 ° C.
Tips - Vortex varje rör minst var 10 minut under denna 30 minuter. - Mikrofugrör i 30 sekunder vid 2000 rpm och överföra eluenten till en ny mikrofugrör.
Tips - Under elueringen, tina din inmatning prover och lägga till 500 mikroliter Elution Buffert till var och en. Inkludera dessa prover i alla steg framöver. - Lägg till 5 M NaCl till en slutlig koncentration på 200 mm alla prover och skaka.
- Inkubera vid 65 ° C över natten (eller minst 4 timmar).
DEL 3: RENA ChIP'd och INPUT DNA
- Mikrofugrör alla prover i 30 sekunder för att samla in kondens på lock.
- Lägg 1μL av RNAse A (10 U / l) till varje rör och inkubera vid rumstemperatur i 15 minuter.
- Tillsätt 10 mikroliter 0,5 M EDTA, 40 mikroliter 0,5 M Tris-Cl pH 6,5, 2 mikroliter proteinas K (10 mg / ml) och inkubera vid 45 ° C i 60 minuter. Tips Förbered en mästare blandning av dessa reagenser och lägga till 52 mikroliter till varje rör.
- Fenol / kloroform / Isoamyl alkohol extrakt och sedan kloroform / Isoamyl alkohol extrahera prover.
- Tillsätt 2 mikroliter glykogen (25 mikrogram / l) och 0,1 volymer av 3M Na acetat pH 5,2 och skaka.
- Lägg till 2,5 volymer av 100% etanol och skaka.
- Inkubera vid 20 ° C över natten.
DEL 4: RENA ChIP'd och INPUT DNA FORTSATT
- Mikrofugrör prover i minst 20 minuter vid 13 tusen rpm vid 4 ° C att fälla ut DNA / glykogen pellets.
- Tvätta med DNA / glykogen pellets med 1 ml 70% etanol.
- Lufttorka pellets eller snabbt torka i DNA Savant hastighet vakuum centrifugen.
Tips - Dra inte torka DNA. - Resuspendera DNA / glykogen pellets i 200 mikroliter TE buffert.
- DNA (1 mikroliter) är klar för kvantifiering via realtids-PCR. Förvara återstående DNA vid 20 ° C.
Tips - Användning av fler än 1 mikroliter av DNA kan hämma realtids-PCR-reaktioner, så skala upp med försiktighet.
Del 5: representativa resultat:
Chip och Input DNA-prover kvantifieras med realtids-PCR 7,8 (Applied Biosystems 7500 Snabb realtids-PCR System) med hjälp av primers specifika för genen locus av intresse. Primers som riktar genomisk sekvens kända för att vara anrikas i eller saknas i histon ändringar som analyseras kan användas som positiva och negativa kontroller också. Data presenteras som Procent av Input. Chip förfarande bör vara helt repeated med tre biologiska replikat för att säkerställa rapporterade förändringar i histon ändringar är statistiskt signifikanta.
Det finns flera viktiga frågor att beakta när man använder realtids-PCR för att kvantifiera DNA, inklusive primer design, PCR effektivitet och ett lämpligt sätt att beräkna procent av input och normalisering förfaranden. När profilering histon modifiering beläggning över en gen, måste PCR-effektiviteten vara konsekvent bland alla primerpar. I realtids-PCR-system Tillverkaren kan lämna nödvändiga uppgifter och utbildning.
Figur 1 visar representativa resultat av kromatin immunoprecipitated under STAT1 aktivering av IRF1 genen 9, utlöses av IFN-γ.
Figur 1. Beläggning av STAT1, RNA-polymeras II och H3K36me3 är dynamisk under STAT1 aktivering av IRF1 genen. (A, B, C) chip med α-H3K36me3, α-STAT1 och α-Pol II av kromatin som samlas in från 2FTGH celler induceras med IFN-γ i 30 minuter (röda fyrkanter), 1,5 timmar (blå cirklar), 5 timmar ( gröna trekanter) eller uninduced (svarta diamanter). IgG är den negativa kontrollen (grå kors). (D) Pan H3 är den positiva kontrollen och visar histon beläggning över locus i de inducerade (blå cirklar) och uninduced förhållanden (svarta diamanter). DIP runt -5 BP beror på nukleosomen utarmning som finns på platser transkription start.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Chip protokoll som beskrivs har använts framgångsrikt i labbet för att analysen mer än tjugo olika histon ändringar. Dessutom har vi präglat förändringar i beläggning av transkriptionsfaktorer, histon-enzym, proteiner som känner igen histon ändringar och RNA-polymeras II transkription maskiner på flera IFN-γ inducerade gener. Vi har också använt förfarandet för att karakterisera förändringar i histon modifieringar under differentiering av en cancer stamceller 10.
Kvaliteten av chip data beror ytterst på hur effektiv den använda antikroppen och det finns en stor variation bland antikroppar. Underlåtenhet att ChIP en ändring därför inte kan tolkas som att dessa förändringar inte är närvarande. Dessutom kan förändringar i en viss förändring observeras i ett chip experiment avspeglar bara en förändring i erkännandet av den epitopen av antikroppen som orsakas av ytterligare histon ändringar på närliggande rester. Därför måste ChIP Resultaten valideras med metoder som kommer att relatera de observerade förändringarna i en histon ändring av en biologisk resultat. När detta är gjort, är chip ett kraftfullt sätt att studera kromatin mekanismer som bidrar till reglering av genuttryck.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av University of Virginia, University of Virginia Cancer Center och Thomas F. och Kate Miller Jeffress Memorial Trust. Vi tackar James E. Darnell Lab (Rockefeller University) Robert Ross Lab (Fordham University) för cellinjer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37% Formaldehyde | Fisher Scientific | BP531-500 | |
| Chloroform/Isoamyl alcohol | Acros Organics | AC32715-5000 | |
| Complete Mini Protease Inhibitors | Roche Group | 1836153 | |
| Cosmic Calf Serum | Hyclone | SH30087.04N | |
| DMEM | Hyclone | SH30243 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP118-500 | |
| Ethanol | Pharmco Products, Inc. | zp1110EP | |
| Glycine | Roche Group | 100149 | |
| Glycogen | Roche Group | 901393 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3784 | |
| IFN-gamma | R&D Systems | 285-IF-100 | |
| IgG | Jackson ImmunoResearch | 109-005-003 | |
| KCl | MP Biomedicals | ||
| LiCl | Sigma-Aldrich | L4408 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Sodium Acetate | Fisher Scientific | BP333-500 | |
| Deoxycholic Acid Sodium Salt | Fisher Scientific | BP349-100 | |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| NP40 | US Biological | N3500 | |
| Anti-Histone H3, CT, pan | EMD Millipore | 07-690 | |
| Phenol/chloroform/isoamyl | Fisher Scientific | 108-95-2 | |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| PMSF | EMD Millipore | 50-230-0316 | |
| Proteinase K | 5 PRIME | 2500140 | |
| RNAse A | 5 PRIME | 2500130 | |
| Salmon Sperm DNA/Protein A Agarose | EMD Millipore | 16-157 | |
| Salmon Sperm DNA/Protein G Agaorse | EMD Millipore | 16-201 | |
| SDS | Fisher Scientific | BP166-500 | |
| Tris-Cl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Triton X-100 | Acros Organics | 327372500 | |
| Anti-K36me3 | Abcam | ab9050 | |
| Anti-STAT1 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-345X | |
| Anti-RNA Polymerase II | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-899 |
References
- Levy, D., Darnell, J. E. Signalling: Stats: transcriptional control and biological impact. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3, 651-662 (2002).
- Bromberg, J., Darnell, J. E. Jr The role of STATs in transcriptional control and their impact on cellular function. Oncogene. 19, 2468-2473 (2000).
- Hu, X., Ivashkiv, L. B. Cross-regulation of signaling pathways by interferon-gamma: implications for immune responses and autoimmune diseases. Immunity. 31, 539-550 (2009).
- Campos, E. I., Reinberg, D.
- Kouzarides, T.
- Jenuwein, T., Allis, C. D.
- Wittwer, C. T., Herrmann, M. G., Moss, A. A., Rasmussen, R. P. Continuous fluorescence monitoring of rapid cycle DNA amplification. Biotechniques. 22 (130-131), 134-138 (1997).
- Higuchi, R., Dollinger, G., Walsh, P. S., Griffith, R. Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences. Biotechnology (N Y). 10, 413-417 (1992).
- Kroger, A., Koster, M., Schroeder, K., Hauser, H., Mueller, P. P.
- Ross, R. A., Spengler, B. A.
