Summary
このプロトコルは、クロマチン免疫沈降（ChIP）はシグナル伝達経路によって誘導される転写を調節するクロマチンテンプレートに動的な変化を研究するために使用される方法について説明します。
Abstract
細胞外リガンドの種類に応じで、STAT（転写のシグナルトランスデューサーおよびアクチベーター）の転写因子は、急速にそれらが単一のチロシン残基1のリン酸化によって活性化される細胞表面の受容体の細胞質に彼らの潜在的な状態から採用されています。そして、彼らは二量体化と成長、分化、恒常性と免疫応答に影響を及ぼす、標的遺伝子の転写を駆動するために核内に移行。当然のことながら、正常な細胞プロセスにおけるそれらの広範な関与を考えると、STATの機能の調節不全は、特に癌2および自己免疫疾患3に、人間の病気に貢献しています。
それはよく転写が4,5クロマチン鋳型への変化によって調節されることを確立されている。これらの変化はATP依存性複合体だけでなく、共有結合性のヒストン修飾とDNAメチル化6の活動が含まれています。遺伝子発現のSTATの活性化が急速かつ一過性でもあるので、STAT依存性遺伝子座における変調クロマチンテンプレートの特定のメカニズムが必要です。これらのメカニズムを定義するには、我々は、ヒストン修飾とSTATシグナルに応答する遺伝子座でそれらを生成する酵素活性を特徴づける。このプロトコルは、クロマチン免疫沈降、STATが活性化する遺伝子の発現にクロマチンにシグナル伝達の研究のための貴重な方法を説明します。
Protocol
プランニング
ChIP実験が予定されている日前に、細胞は十分な数が利用できるように、培養すべきである。各ChIPアッセイでは〜1から1.5 × 10 7個の細胞が必要になることを前提としています。常に負（IgG抗体）と正（パンヒストン抗体）のコントロールと重複実験の両方を行う予定です。
ヒント - 2FTGHセルの場合、各ChIPアッセイは、80％コンフルエントで15約一cmの組織培養皿が必要です。
PART 1：クロマチンを調製し、チップのPERFORM
- 培地を取り出し、5 ng / mLのでIFN -γを含有する10％宇宙の子牛血清（CCS）/ DMEM 20mLで必要な時間のために細胞を誘導する。 CCS / DMEMに加え10％の20mLで非誘導プレート上でメディアを交換してください。
- ドラフトでは、15cmの皿の中でメディアを20mL（1％最終濃度）に540μLの37％ホルムアルデヒドを追加。
ヒント -チルトプレートとメディアプールにホルムアルデヒドを追加-均等にそれを広めるためにしてロックプレート。 - 室温で10分間進行さ架橋を許可する。
- 架橋を停止するには、0.125 Mの最終濃度にグリシンを追加。
- 真空は、培地を吸引除去し、緩衝生理食塩水（PBS）を10mLの氷冷リン酸で細胞を1回洗浄する。
- 〜7 mLのPBSでセルスクレーパーで細胞を回収し、氷上で50 mLコニカルチューブに同じ処理した細胞を（6プレートから）組み合わせる。
- 4℃で1800rpmで遠心分離（ベックマンCoutlerアレグラ12 - R遠心）℃で5分間とPBSを吸引除去する。
ヒント -スナップ凍結細胞ペレットであればここに停止し、-80℃で保存します。 - 4 mLの膨潤バッファー（25mMのHEPES pHは7.8、1.5mMのMgCl 2、10mMの塩化カリウム、0.1％NP40。1mMのDTT、完全なプロテアーゼ阻害剤と使用前に氷上で寒さを追加）で細胞ペレットを再懸濁し、15に転送するmLコニカルチューブ。
ヒント -この膨潤バッファーの量は、6プレートプール（〜6月9日× 10 7細胞）に適しています。多かれ少なかれ、バッファがdouncing効率が変わることがあります。 - 10分間氷上で細胞懸濁液をインキュベートする。
- あらかじめ冷却した15 mLのdouncer（ウィートン）に懸濁液を移すと乳棒Aで20ストロークをダウンス
- 転送には氷の上に15 mLコニカルチューブに戻し、細胞をdounced。
- 4℃で5分間2500rpmで遠心℃、上清を捨てる。
- 超音波の緩衝液3mlで核ペレットを（6枚から〜200μL）（15ペレットの量）（50mMのHEPES pHは7.9、140mMのNaCl、1mMのEDTA、1％トリトンX - 100、0.1％デオキシコール酸ナトリウム、再懸濁します。 0.1％SDS。）使用直前に氷の上で完全なプロテアーゼ阻害剤と寒さを追加。
ヒント -この超音波処理バッファーの量は、6プレートプール（〜6月9日× 10 7細胞）に適しています。多かれ少なかれバッファは、超音波処理の効率が変わることがあります。 - マイクロチップのついたMisonixのソニケーター3000を使用して10サイクル（20秒8の設定on/40秒オフ/振幅）を氷上で核懸濁液を超音波処理してください。これは、通常サイズで200〜1000 bpsを平均化クロマチンの断片をもたらす。
ヒント - sonicatorsが異なるため、超音波処理の効率が経験的に決定する必要があります。そのためには、超音波処理の前に、各超音波処理のサイクル後に20μLのアリコートを取る。 4時間65℃で、これらのサンプルを加熱する。 DNAのローディングバッファーを追加し、DNA断片を可視化するために標準の1％アガロース/ TBEゲルを実行してください。） - 転送は、4℃で20分間SS34遠心管と遠心する材料を超音波処理° SS34ローター（ソーバルRC6プラス遠心）で13000rpmでCペレットに、通常細胞の残骸の小さい量が何であるか。
- 慎重に氷の上に15 mLコニカルチューブに上清を移す。
- 360μLサケ精子DNA /プロテインAまたはGアガロースビーズのスラリーを追加し、少なくとも30分間、4℃で揺れによる事前クリア。
ヒント -この手順では、非特異的な結合事象から発生するアッセイでのノイズを減少させる。 - ペレットアガロースビーズへの5分間4℃で1000rpmで遠心する。
- 氷の上に別の15 mLコニカルチューブに上清をあらかじめクリアに転送します。
- 事前にクリアクロマチンのA260ユニットを測定し、4（4）A260ユニット（0.2 mg / mLの1 A260ユニット= 0.050 mg / mlのを前提）に超音波処理バッファーを使用して、音量を調節する
ヒント - A260の単位を測定するには、190μlのDDWで事前にクリアクロマチンの10μLの希釈し、190μlのDDWで10μL超音波処理のバッファを持つ空白の分光光度計を。 - 20℃入力のサンプルとストアとしてクロマチンの75μLを（4 A260単位で）保存° C架橋を逆にする準備が整うまで。
ヒント -この手順では、データ解析のための非常に重要です。入力のアリコートを取ることを無視しないでください。 - 私上を1.7 mLマイクロチューブに分注して調製したクロマチンを1mLのアリコートとしてCE。
ヒント -ここに停止する場合は、-80℃ドライアイスとストアの準備クロマチンを凍結スナップ℃にNBは：可能であれば保存されているクロマチンが少なく、最適な結果よりも生産する、低下することができるので、避けてください。 - 重複の誘導および非誘導サンプルセットへのChIPグレード抗体を追加。誘導および非誘導サンプルセットへの陰性および陽性対照としてIgG抗体（2μg）を、パンヒストンH3抗体（15μL）を追加します。
ヒント -使用する抗体の量は、経験的に決定するかあるいは提案された量のために供給業者の製品のシートを参照してくださいする必要があります。のChIPグレード抗体の一般的に1〜2μgのが適しています。適切なボリュームは、血清として供給される抗体のために経験的に決定する必要があります。 - 一晩4のチューブを揺する℃に
PART 2：免疫複合体のCOLLECT
- すべてのチューブにサケ精子DNA /タンパク質またはプロテインGアガロースビーズのスラリー60μLを加える。
マウスモノクローナル抗体のウサギポリクローナル抗体とプロテインGのためのヒントを使用するタンパク質。 - 少なくとも60分間、4 ° Cでロック。
- 4℃で2000rpmで静かにmicrofugingによるペレットは免疫複合体（アガロースビーズ）℃で3分間。
- 上清を吸引除去する。
- 4℃を揺動し、10分間、次洗浄バッファーの各1mLで免疫複合体を洗う4℃、2000rpmで3分間、マイクロ·各洗浄し、上清を吸引間C。氷上で冷却し、サンプルをしてください。使用直前にPMSFを追加。
- 低塩ウォッシュ - 0.1％SDS、1％トリトンX - 100、2mMのEDTA、20mMのトリス- Cl、pHは8.0、150mMのNaCl、1mMのPMSF
- 高ソルトウォッシュ - 0.1％SDS、1％トリトンX - 100、2mMのEDTA、20mMのトリス- Cl、pHは8.0、500mMのNaCl、1mMのPMSF
- 塩化リチウムウォッシュ - 0.25 M塩化リチウム、1％NP - 40、1％デオキシコール酸ナトリウム、1mMのEDTA、10mMのトリス- Cl、pH8.0の、1mMのPMSF
- TEウォッシュ - TEバッファー-10 mMのトリス- Cl、pH8.0の、1mMのEDTA、1mMのPMSFで2回洗浄
- 最後のTEバッファー洗浄を削除し、ビーズに、500μlの溶出バッファー（50mMのトリス- Cl、pH8.0の、10mMのEDTA、1％SDS）を追加します。
ヒント -溶出バッファーを新しく調製する必要がある。 - 65℃30分間溶出緩衝液と熱にアガロースビーズを混在させる渦℃に
ヒント -この30分間、各チューブは、少なくとも10分おきにボルテックス。 - 2000rpmで30秒間、マイクロと新しいマイクロ遠心チューブに溶離液を移す。
ヒント -溶出時には、ご入力のサンプルを解凍し、それぞれに500μlの溶出バッファーを追加します。今後すべてのステップでこれらのサンプルが含まれています。 - すべてのサンプルと渦〜200 mMの最終濃度を5 M NaClを追加します。
- 65℃で一晩（または少なくとも4時間）。
PART 3：PurifyをChIP'dと入力のDNA
- 蓋に結露を収集するために30秒間のすべてのサンプルをマイクロフュージ。
- 15分間室温で各チューブとインキュベートしてRNase Aを1μlの（10 U /μL）を追加します。
- 10μLの0.5 M EDTA、40μL、0.5 Mトリス- Cl pH6.5で、2μLプロテイナーゼK（10 mg / mL）に追加し、45℃で60分間、℃でインキュベートする。ヒントは、これらの試薬のマスターミックスを調製し、各チューブに52μLを加える。
- フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール抽出し、クロロホルム/イソアミルアルコールは、サンプルを抽出。
- 2μLグリコーゲン（25μg/μLの）と3M酢酸Na液（pH5.2）と渦0.1ボリュームを追加します。
- 100％エタノールと渦の2.5倍量を追加。
- 20℃で一晩。
パート4：PurifyをChIP'dと入力のDNAつづき
- 4℃13000rpmで20分以上のための微量サンプル° C DNA /グリコーゲンペレットを沈殿させる。
- 70％エタノール1mLでDNA /グリコーゲンペレットを洗浄する。
- 空気は、DNA Savant社の高速真空遠心分離でペレットまたは迅速に乾燥して乾燥させる。
ヒント -上のDNAを乾燥させないでください。 - 200μLのTE緩衝液にDNA /グリコーゲンペレットを再懸濁します。
- DNA（1μL）は、リアルタイムPCRによる定量のための準備ができています。 20店舗、残りのDNA℃に
ヒント - DNA以上の1μLを使用して、リアルタイムPCR反応を阻害することができるので、注意してスケールアップ。
パート5：代表的な結果：
チップと入力DNAサンプルは、目的の遺伝子座に特異的なプライマーを用いたリアルタイムPCR 7,8（アプライドバイオシステムズ7500 FastリアルタイムPCRシステムを応用）を用いて定量されています。に濃縮またはアッセイされるヒストン修飾に欠けていることが知られているターゲットのゲノム配列が同様に陽性および陰性コントロールとして使用することができるプライマー。データは入力のパーセントとして表されます。 ChIPの手順は完全にしてくださいR生物はヒストン修飾で報告された変化は統計的に有意であることを保証するために複製うち3 epeated。
プライマー設計、PCRの効率、および入力と正規化手順のパーセントを計算するために適切な方法を含むDNAを、定量化するためにリアルタイムPCRを使用する際に考慮すべきいくつかの重要な問題があります。遺伝子を越えヒストン修飾の占有率をプロファイル化する場合、PCRの効率は、全てのプライマーペア間で一貫している必要があります。リアルタイムPCRシステムのメーカーは、必要な情報とトレーニングを提供することができます。
図1に、クロマチンの代表的な結果は、IFN -γによって引き起こされる、IRF1遺伝子9のSTAT1活性化中に免疫沈降を示しています。
図1。 STAT1、RNAポリメラーゼIIとH3K36me3の占有はIRF1遺伝子のSTAT1活性化中に動的です。 （A、B、C）α- H3K36me3、α- STAT1と2FTGH細胞から採取したクロマチンのα-ポルIIを持ったチップはIFN -γのための30分（赤い四角）、1.5時間（青丸）、5時間（で誘導緑色の三角形）または非誘導（ブラックダイヤモンド）。 IgGは、ネガティブコントロール（グレー×印）です。（D）パンH3は、ポジティブコントロールであると誘導（青丸）での遺伝子座でヒストン占有および非誘導条件（ブラックダイヤモンド）を示しています。 -5 BP周りディップでは、転写開始部位で発見されたヌクレオソーム枯渇によるものです。
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Discussion
概説ChIPのプロトコールは、20を超える異なるヒストン修飾アッセイするために、ラボで正常に使用されています。さらに、我々は転写因子の占有率の変化、いくつかのIFN -γ誘導される遺伝子におけるヒストン修飾酵素、ヒストン修飾やRNAポリメラーゼIIの転写機構を認識するタンパク質を、特徴付けている。我々はまた、癌幹細胞10の分化中にヒストン修飾の変化を特徴づけるための手順を使用している。
チップデータの品質は最終的に使用される抗体の有効性に依存すると抗体の間でかなりのばらつきがある。変更をチップに障害が、そのため、修正が存在しないということを意味すると解釈することができます。また、ChIP実験で観察された特定の変更の変化は、単に近くの残基での追加のヒストン修飾に起因する抗体によるエピトープの認識の変化を反映しているのかもしれない。このため、ChIPの結果は、生物学的結果にヒストン修飾で観測された変化を関連付けるだろうなアプローチで検証する必要があります。これが完了すると、チップは、遺伝子発現の調節に寄与するクロマチンベースのメカニズムを研究する強力な方法です。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
この作品は、バージニア大学、バージニア大学がんセンターとトーマスF.とケイトミラーJeffressメモリアルトラストによってサポートされています。我々は、細胞株についてはジェームズE.ダーネルラボ（ロックフェラー大学）ロバートロスラボ（フォーダム大学）に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37% Formaldehyde | Fisher Scientific | BP531-500 | |
| Chloroform/Isoamyl alcohol | Acros Organics | AC32715-5000 | |
| Complete Mini Protease Inhibitors | Roche Group | 1836153 | |
| Cosmic Calf Serum | Hyclone | SH30087.04N | |
| DMEM | Hyclone | SH30243 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP118-500 | |
| Ethanol | Pharmco Products, Inc. | zp1110EP | |
| Glycine | Roche Group | 100149 | |
| Glycogen | Roche Group | 901393 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3784 | |
| IFN-gamma | R&D Systems | 285-IF-100 | |
| IgG | Jackson ImmunoResearch | 109-005-003 | |
| KCl | MP Biomedicals | ||
| LiCl | Sigma-Aldrich | L4408 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Sodium Acetate | Fisher Scientific | BP333-500 | |
| Deoxycholic Acid Sodium Salt | Fisher Scientific | BP349-100 | |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| NP40 | US Biological | N3500 | |
| Anti-Histone H3, CT, pan | EMD Millipore | 07-690 | |
| Phenol/chloroform/isoamyl | Fisher Scientific | 108-95-2 | |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| PMSF | EMD Millipore | 50-230-0316 | |
| Proteinase K | 5 PRIME | 2500140 | |
| RNAse A | 5 PRIME | 2500130 | |
| Salmon Sperm DNA/Protein A Agarose | EMD Millipore | 16-157 | |
| Salmon Sperm DNA/Protein G Agaorse | EMD Millipore | 16-201 | |
| SDS | Fisher Scientific | BP166-500 | |
| Tris-Cl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Triton X-100 | Acros Organics | 327372500 | |
| Anti-K36me3 | Abcam | ab9050 | |
| Anti-STAT1 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-345X | |
| Anti-RNA Polymerase II | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-899 |
References
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- Bromberg, J., Darnell, J. E. Jr The role of STATs in transcriptional control and their impact on cellular function. Oncogene. 19, 2468-2473 (2000).
- Hu, X., Ivashkiv, L. B. Cross-regulation of signaling pathways by interferon-gamma: implications for immune responses and autoimmune diseases. Immunity. 31, 539-550 (2009).
- Campos, E. I., Reinberg, D.
- Kouzarides, T.
- Jenuwein, T., Allis, C. D.
- Wittwer, C. T., Herrmann, M. G., Moss, A. A., Rasmussen, R. P. Continuous fluorescence monitoring of rapid cycle DNA amplification. Biotechniques. 22 (130-131), 134-138 (1997).
- Higuchi, R., Dollinger, G., Walsh, P. S., Griffith, R. Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences. Biotechnology (N Y). 10, 413-417 (1992).
- Kroger, A., Koster, M., Schroeder, K., Hauser, H., Mueller, P. P.
- Ross, R. A., Spengler, B. A.
