Summary
ويرد على أساس أسلوب رامان المجهري متحد البؤر التي تتيح تسمية خالية من التصور اللجنين في جدران الخلايا النباتية ومقارنة lignification في الأنسجة المختلفة ، وعينات أو الأنواع.
Protocol
1. تحضير العينة
- جبل العينة النباتية المائية ، مثل الخشب أو جذع شجرة الحور Arabidopsis thaliana الجذعية ، في مشراح.
- خفض الشرائح الرقيقة (عادة 20 ميكرون سميكة) من النسيج الأصلي.
- نقل قسم النبات على شريحة ميكروسكوب زجاجية.
- نقع قسم النبات في D 2 O ، وتغطي مع كوب زلة تغطية ، وهي مختومة على الشريحة مجهر لمنع تبخر D 2 O. قسم النبات هو الآن جاهز للتصوير أو يمكن تخزينها لاستخدامها في المستقبل.
2. نموذج القياس
- تطبيق زيت الغمر في تحقيق الهدف المجهر و / أو زلة غطاء.
- مكان وتأمين شريحة مجهر المسح على المسرح كهرضغطية من المجهر ، مع انزلاق الغطاء تواجه الهدف المجهر.
- عرض عينة من خلال زلة تغطية عالية باستخدام الغمر الفتحة العددية الهدف المجهر (100X ، NA = 1.40) ، وتحديد منطقة عينة من الفائدة.
- يتم إجراء قياسات microspectroscopic بعد إيقاف جميع ضوء المختبرية وغيرها من مصادر المجهر ، والموقف ، من خلال التركيز حل ممر الموجة مفلتر الضوء الاخضر أحادي اللون (λ = 532 نانومتر) من CW - بالليزر على عينة نموذجية مع قوة من 10 إلى 30 ميغاواط ( انظر الشكل رقم 1 لالتخطيطي من الإعداد). تألق ذاتي يمكن أن يحدث في بعض العينات ، والتي قد تمنع قياسات مفيدة ، والذي يعد إثارة القضية مع ضوء الليزر الطول الموجي قد يكون من المستحسن.
- يتم جمع متناثرة الضوء الخلفي رامان ستوكس التي تحول الهدف المجهر ، يمر من خلال مرآة مزدوج اللون ، وذات الثقب ، والتي هي بمثابة تصفية المكانية في الإعداد مبائر ، وتصفية longpass ، ويركز في الشق من صريف مطياف ، حيث فرقت طيفيا الضوء والكشف عنها بواسطة كاميرا CCD تبريده ، وإعطاء الطيف رامان. ويرد الطيف رامان من خشب الحور في الشكل 2 ، مع العصابات اللجنين مميزة في المنطقة الطيفية بين 1600 و 1700 سم -1.
- التصوير الكيميائية والتصور للتوزيع المكاني اللجنين ، وحصلت على خريطة ثنائية الأبعاد الطيفي بواسطة النقطية مسح العينة من خلال التركيز الليزر مع مرحلة فحص وتسجيل كهرضغطية طائفة رامان لكل موقف العينة. قد يكون إنشاء خرائط ثلاثية الأبعاد الطيفي بواسطة التراص ثنائي الأبعاد لخرائط التي كانت كثفت التركيز على التوالي ليزر على طول ض الاتجاه.
3. تحليل البيانات
- التصوير الكيميائية والتصور اللجنين ، ويتم تحليل البيانات التي تم جمعها باستخدام MATLAB (MathWorks ، الإصدار 7.7). يتم ترتيب البيانات في مكعب ثلاثي الأبعاد الفائقة الطيفية ، التي تتألف من البعدين المكاني والبعد الثالث للإشارات الطيفية.
- لتحليل اللجنين ، تعتبر المنطقة الطيفية بين 1550 و 1700 سم -1 (انظر الشكل 2). التوزيع المكاني للاللجنين هو تصور من خلال دمج كثافة من 1550 إلى 1700 سم -1 من الأطياف الأساس لتصحيح (انظر الشكل 3). كبديل للتصويب خط الأساس ، يمكن حسابها الثاني مشتق الأطياف والقمم الثاني مشتق تستخدم للتحليل.
- قد تكون اللجنين التعريب والكيمياء ، وخاصة فيما يتعلق coniferaldehyde والأنصاف coniferyl الكحول ، لمزيد من التحليل من خلال تقييم المنطقة تحت قمم غاوسي تركيبها من المجموعات الثلاث وجدت بين 1600 و 1700 سم -1 (انظر الشكل رقم 2 من أقحم والحكام 15 -- 17).
- يتم تنفيذ التطبيع بين الكثافة الطيفية المختلفة باستخدام الخرائط كمرجع ذروة الذروة من الفرقة OD خارجي يمتد حوالي 2500 سم -1 في أطياف التجويف المتوسط ، والتي حصلت عليها ك يعني تصنيف المجموعات. هذا أمر بالغ الأهمية ، ويسمح احد لشدة مقارنة إشارة اللجنين بين القياسات المختلفة والأنسجة ، وعينات والأنواع.
4. ممثل النتائج
ويرد ممثل الطيف رامان من خشب الحور الجذعية (حور angustifolia) في الشكل رقم 2. تم العثور على نطاقات اللجنين مميزة في المنطقة الطيفية بين 1600 و 1700 سم -1. كمثال على ذلك ، يتم تقديم التوزيع المكاني للاللجنين في شريحة خشب الحور في الشكل 3. مقارنة لصورة مرئية ، شكليا مناطق متميزة جدار الخلية تصبح تمييزها بوضوح بسبب كثافة مختلفة اللجنين الإشارة. ويلاحظ ارتفاع الكثافة إشارة اللجنين في زوايا الخلية (CC) ، وإلى حد ما أقل ، في مجمع صفاحات المتوسطة (CML). ولوحظت كميات أقل ، ولكن لا يستهان بها ، من اللجنين داخل الجدار S2 طبقة من الألياف. تم العثور على تباين كثافة اللجنين إشارة إلى حد ما داخل CC ، CML وS2 ، وخاصة من الألياف إلى الألياف. القرار المكانية الوحشي في القياسات لدينا ~ 300 نانومتر. جودة البيانات يفسح المجال بشكل جيد للمقارنة بين lignificationعينات وكذلك تشريح اللجنين الكيمياء 15.
الشكل 1 : والتخطيطي للإعداد أداة BP : ممر الموجة مرشح ؛ DM : مرآة مزدوج اللون ، ودرجة الحموضة : الثقب ؛ ليرة لبنانية : longpass التصفية.
الرقم 2 : طيف ممثل من خشب الحور رامان الجذعية (حور angustifolia) التي سجلت في D 2 O. منطقة الضوء الطيفي (انظر أيضا أقحم) علامات المنطقة الطيفية وجود ثلاث قمم تعزى على وجه التحديد إلى اللجنين.
الشكل 3 : رامان اللجنين الصورة (أسفل) من شريحة خشب الحور (أعلى : صورة مرئية) ، التي تم الحصول عليها من خلال دمج كثافة إشارة رامان من 1550 إلى 1700 سم -1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هي مواد Lignocellulosic الهرمي وغير متجانسة فيما يتعلق بكل من هيكلها وتكوينها. لتوصيف الأدوات التحليلية المتعمقة التي الحساسية الكيميائية ، القرار المكانية ، والتي تعطي نظرة ثاقبة هذه المواد في سياق الأم ومرغوب فيه. وصف الأسلوب يتيح للتصور اللجنين ومقارنة lignification من الكتلة الحيوية النباتية lignocellulosic مع القرار المكانية التي هي دون تلوين أو ميكرومتر دون وضع العلامات من العينات في حالة قريبة من الأصلي. فهي تتطلب الحد الأدنى من إعداد العينات والقياسات غير المتلفة وغير مكلفة نسبيا. يمكن أن تكون مفيدة في طريقة تقييم lignification المرتبطة بعدد كبير من السكان تربية. بالإضافة إلى اللجنين ، أطياف رامان تحتوي أيضا على بصمات طيفية من السليلوز وhemicelluloses ، والتي يمكن تضمينها في تحليل شامل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نشكر اندرو كارول ، Chaibang برايت ، Purbasha ساركار (الطاقة الحيوية للعلوم معهد بيركلي) ، بهرام بارفين (مختبر لورانس بيركلي الوطني) وتشيانغ فنسنت لام (ولاية كارولينا الشمالية جامعة) للتعاون المثمر ومناقشات مفيدة. وأيد هذا العمل من قبل معهد العلوم البيولوجية الطاقة. وأيد العمل في مسبك الجزيئية من مكتب العلوم ومكتب للعلوم الأساسية للطاقة ، وزارة الطاقة في الولايات المتحدة بموجب العقد رقم DE - AC02 - 05CH1123.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| microscope slides | |||
| cover slips | |||
| D2O | |||
| nail polish | |||
| immersion oil | |||
| tweezers | |||
| pointed brush | |||
| microtome | |||
| confocal Raman microscope |
References
- Herrera, S.
- Himmel, M. E. Biomass recalcitrance: Engineering plants and enzymes for biofuels production. Science. 315, 804-807 (2007).
- Pauly, M., Keegstra, K. Cell-wall carbohydrates and their modification as a resource for biofuels. Plant J. 54, 559-568 (2008).
- Pauly, M., Keegstra, K. Physiology and metabolism 'Tear down this wall. Curr Opin Plant Biol. 11, 233-235 (2008).
- Ragauskas, A. J. The path forward for biofuels and biomaterials. Science. 311, 484-489 (2006).
- Somerville, C.
- Ralph, J., Brunow, G., Boerjan, W. Lignins in Encyclopedia of Life Sciences. , John Wiley & Sons. Chichester. (2007).
- Chiang, V. L.
- Atalla, R. H., Agarwal, U. P. Raman microprobe evidence for lignin orientation in the cell walls of native woody tissue. Science. 227, 636-638 (1985).
- Atalla, R. H., Agarwal, U. P. Recording Raman spectra from plant cell walls. J Raman Spectrosc. 17, 229-231 (1986).
- Fukushima, K. Regulation of syringyl to guaiacyl ratio in lignin biosynthesis. J Plant Res. 114, 499-508 (2001).
- Agarwal, U. P. Raman imaging to investigate ultrastructure and composition of plant cell walls: distribution of lignin and cellulose in black spruce wood (Picea mariana). Planta. 224, 1141-1153 (2006).
- Gierlinger, N., Schwanninger, M. Chemical imaging of poplar wood cell walls by confocal Raman microscopy. Plant Physiol. 140, 1246-1254 (2006).
- Gierlinger, N., Schwanninger, M. The potential of Raman microscopy and Raman imaging in plant research. Spectrosc Int J. 21, 69-89 (2007).
- Schmidt, M. Label-free in situ imaging of lignification in the cell wall of low lignin transgenic Populus trichocarpa. Planta. 230, 589-597 (2009).
- Agarwal, U. P. An Overview of Raman Spectroscopy as Applied to Lignocellulosic Materials. Advances in Lignocellulosics Characterization. Argyropoulos, D. S. , TAPPI Press. Atlanta, GA. 201-225 (1999).
- Agarwal, U. P., Ralph, S. A. Determination of ethylenic residues in wood and TMP of spruce by FT-Raman spectroscopy. Holzforschung. 62, 667-675 (2008).
- Schmidt, M. Raman imaging of cell wall polymers in Arabidopsis thaliana. Biochem Biophys Res Comm. 395, 521-523 (2010).
