Summary
En metod baserad på konfokala Raman mikroskopi presenteras som ger etiketten utan visualisering av lignin i växternas cellväggar och jämförelse av lignification i olika vävnader, prover eller arter.
Abstract
Möte växande energibehov på ett säkert och effektivt sätt finns ett trängande global utmaning. Därför har forskning kring produktion av biobränslen som syftar till att hitta kostnadseffektiva och hållbara lösningar blir en aktuell och viktig uppgift. Lignocellulosa är redo att bli den främsta källan till biomassa för konvertering till flytande biobränslen 1-6. Däremot presenterar motspänstighet av dessa vägg växtcell material till kostnadseffektiv och effektiv nedbrytning ett stort hinder för deras användning i produktionen av biobränslen och kemikalier 4. Framför allt blir lignin, en komplex och oregelbunden poly-phenylpropanoid heteropolymer, problematiskt att de postharvest dekonstruktion av lignocellulosa. Till exempel i biomassa konvertering till biobränsle, hämmar det försockringen i processer som syftar till att producera enkla sockerarter för jäsning 7. En effektiv användning av växt-biomassa för industriella ändamål är i själva verket stor del beroende av i vilken omfattning anläggningen cellväggen är förvedade. Borttagandet av lignin är en dyr och begränsande faktor 8 och lignin har därför blivit en viktig växtförädling och genteknik mål för att förbättra konverteringen cellvägg.
Analytiska verktyg som möjliggör noggrann snabb karaktärisering av lignification av växternas cellväggar blivit allt viktigare för att utvärdera ett stort antal häckande populationer. Extraktiva förfaranden för isolering av infödda komponenter såsom lignin oundvikligen destruktiva, åstadkomma betydande kemiska och strukturella förändringar 9-11. Analytisk kemiska in situ metoder är därför ovärderliga verktyg för sammansättning och strukturella karakterisering av lignocellulosa. Raman mikroskopi är en teknik som bygger på oelastisk eller Ramanspridning av monokromatiskt ljus, som det från en laser, där övergången i energi av laser fotoner är relaterat till molekylära vibrationer och presenterar en inneboende etikett-fri molekylära "fingeravtryck" av provet . Ramanmikroskopi råd med icke-förstörande och förhållandevis billiga mätningar med minimal provberedning och ger insikter i kemiska sammansättning och molekylära struktur i en nära infödd stat. Kemisk avbildning av konfokala Raman mikroskopi har använts tidigare för visualisering av den rumsliga fördelningen av cellulosa och lignin i väggar av trä cell 12-14. Baserat på dessa tidigare resultat, har vi nyligen antagit denna metod för att jämföra lignification i vildtyp och lignin-brist transgena Populus trichocarpa (svart bomullsträd) stamved 15. Analysera lignin Raman banden 16,17 i den spektrala regionen mellan 1600 och 1700 cm -1, lignin signal intensitet och lokalisering kartlades på plats. Vår strategi visualiseras skillnader i lignin innehåll, lokalisering och kemiska sammansättning. Senast visade vi Raman avbildning av polymerer cellvägg i Arabidopsis thaliana med lateral upplösning som är sub-ìm 18. Här presenteras denna metod som ger visualisering av lignin i växternas cellväggar och jämförelse av lignification i olika vävnader, prover eller arter utan färgning eller märkning av vävnader.
Protocol
1. Provberedning
- Montera hydratiserade anläggningen prov, t.ex. poppel stam trä eller Arabidopsis thaliana beror i mikrotomen.
- Skär tunna sektioner (normalt 20 mikrometer tjock) från det ursprungliga vävnaden.
- Överför anläggningen sektionen på ett glas objektglas.
- Blötlägg anläggningen avsnitt i D 2 O och täck med en glaskupa slip, som är förseglad på objektglas för att förhindra avdunstning av D 2 O. Anläggningen delen är nu klar för avbildning eller det kan lagras för framtida användning.
2. Exempel på mätning
- Applicera immersionsolja till mikroskop mål och / eller täckglas.
- Placera och fäst objektglas på piezoelektriska skanna skede av mikroskop, med locket glida mot mikroskop målet.
- Visa provet genom locket glida med en hög numerisk bländare mål nedsänkning mikroskop (100x, NA = 1,40) och placera provet område av intresse.
- Efter att stänga av alla andra laboratorium och mikroskop ljuskällor, position-löst microspectroscopic mätningar utförs genom att fokusera bandpass-filtrerad monokromatiskt grönt ljus (λ = 532 nm) från en CW-laser på provet med en typisk effekt på 10 till 30 mW ( se figur 1 för en schematisk av installationen). Autofluorescens kan uppstå i vissa prov, som förbjuder användbara mätningar, i vilket fall excitation med längre våglängd laserljus kan vara lämpligt.
- Back-spridda Stokes återuppspelat Raman ljus samlas in av mikroskop mål, passerar genom en dikroiska spegel, ett hål, som fungerar som en rumslig filter i konfokala setup, och en longpass filter, och fokuseras i slitsen på ett galler spektrometer, där ljuset spektralt splittrad och upptäcks av en kyld CCD-kamera, vilket ger en Ramanspektrum. En Ramanspektrum av poppel trä visas i Figur 2, med karakteristisk lignin band i den spektrala regionen mellan 1600 och 1700 cm -1.
- För kemiska bildbehandling och visualisering av rumslig lignin fördelning, är en två-dimensionell spektrala karta förvärvades av raster scanning provet genom laser fokus med piezoelektriska skanna scenen och spelar in en Ramanspektrum för varje prov position. Tredimensionella spektrala kartor kan genereras genom att stapla tvådimensionella kartor som lasern fokus trappades varandra längs z-riktningen.
3. Data Analysis
- För kemiska avbildning och lignin visualisering, är de insamlade data analyseras med MATLAB (The MathWorks, version 7.7). Uppgifterna är ordnade i ett tredimensionellt hyperspektrala kub, som består av två dimensioner och en tredje dimension för den spektrala signalerna.
- För lignin analysen är den spektrala regionen mellan 1550 och 1700 cm -1 övervägas (se figur 2). Den geografiska fördelningen av lignin visualiseras genom att integrera intensiteten från 1550 till 1700 cm -1 av utgångsvärdet-korrigerade spektra (se figur 3). Som ett alternativ till baseline correction får andra derivat spektra beräknas och den andra derivat toppar som används för analys.
- Lignin lokalisering och kemi, särskilt när det gäller coniferaldehyde och coniferyl beståndsdelarna alkohol kan analyseras ytterligare genom att utvärdera området under monteras Gaussisk toppar av de tre banden hittades mellan 1600 och 1700 cm -1 (se infällda i figur 2 och Refs 15. - 17).
- Intensitet normalisering mellan olika spektrala kartor görs med som referens toppen höjd extrinsic OD stretching band runt 2500 cm -1 i den genomsnittliga lumen spektra, vilka erhålls genom att K-medel klustring klassificering. Detta är kritisk och gör att man kan jämföra lignin signal intensiteter mellan olika mätningar, vävnader, prover och arter.
4. Representativa resultat
En representant Ramanspektrum av poppel (Populus angustifolia) stamved visas i figur 2. Karakteristiska lignin band finns i den spektrala regionen mellan 1600 och 1700 cm -1. Som ett exempel är den geografiska fördelningen av lignin i en poppel trä tvärsnitt som presenteras i figur 3. Jämfört med den synliga bilden, morfologiskt distinkta cellväggen regioner blivit tydligt skiljer sig beroende på olika lignin signalstyrka. Hög lignin signalstyrka observeras i cellen hörnen (CC) och, något mindre, i de sammansatta mitten lameller (KML). Lägre, men inte obetydliga, mängder lignin följs inom S2 väggen lager av fibrer. Variabilitet av lignin signalstyrka finns i viss mån inom CC, KML och S2, särskilt från fiber till fiber. Den laterala rumsliga upplösningen i våra mätningar är ~ 300 nm. Uppgifternas kvalitet lämpar sig väl för att jämföra lignification mellanprover och för att ytterligare dissekera lignin kemi 15.
Figur 1: En schematisk av instrumentella inställning BP:. Bandpassfilter, DM: dikroiskt spegel, PH: hål, LP: longpass filter.
Figur 2: En representant Ramanspektrum av poppel (Populus angustifolia) stamved registreras i D 2 O. Det markerade spektrala området (se även infälld) markerar den spektrala regionen med tre toppar specifikt hänförlig till lignin.
Figur 3: Raman lignin bild (botten) i en poppel trä tvärsnitt (topp: synlig bild), som erhålls genom att integrera Raman signalstyrkan från 1550 till 1700 cm -1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Lignocellulosa är hierarkiska och heterogena både vad gäller struktur och sammansättning. För en fördjupad beskrivning analysverktyg som har kemisk känslighet, rumslig upplösning, och att ge insikter i dessa material i det ursprungliga sammanhanget är önskvärda. Den beskrivna metoden ger visualisering av lignin och jämförelse av lignification av lignocellulosa växtbiomassa med rumslig upplösning som är sub-ìm utan färgning eller märkning av proverna i en nära infödd stat. Det kräver minimal provberedning och mätningarna är icke-förstörande och förhållandevis billigt. Metoden kan vara användbar vid utvärdering lignification förknippas med ett stort antal häckande populationer. Förutom lignin, den Raman spektra innehåller också spektrala fingeravtryck av cellulosa och hemicellulosa, som kan ingå i en omfattande analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi tackar Andrew Carroll, Bright Chaibang, Purbasha Sarkar (energi biovetenskaper Institute, Berkeley), Bahram Parvin (Lawrence Berkeley National Laboratory) och Vincent L. Chiang (North Carolina State University) för givande samarbeten och hjälpsamma diskussioner. Detta arbete stöddes av energi biovetenskaper Institute. Arbeta på molekylär Gjuteri stöddes av Office of Science, Office of Basic Energy Sciences, av US Department of Energy i Kontrakt nr DE-AC02-05CH1123.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| microscope slides | |||
| cover slips | |||
| D2O | |||
| nail polish | |||
| immersion oil | |||
| tweezers | |||
| pointed brush | |||
| microtome | |||
| confocal Raman microscope |
References
- Herrera, S.
- Himmel, M. E. Biomass recalcitrance: Engineering plants and enzymes for biofuels production. Science. 315, 804-807 (2007).
- Pauly, M., Keegstra, K. Cell-wall carbohydrates and their modification as a resource for biofuels. Plant J. 54, 559-568 (2008).
- Pauly, M., Keegstra, K. Physiology and metabolism 'Tear down this wall. Curr Opin Plant Biol. 11, 233-235 (2008).
- Ragauskas, A. J. The path forward for biofuels and biomaterials. Science. 311, 484-489 (2006).
- Somerville, C.
- Ralph, J., Brunow, G., Boerjan, W. Lignins in Encyclopedia of Life Sciences. , John Wiley & Sons. Chichester. (2007).
- Chiang, V. L.
- Atalla, R. H., Agarwal, U. P. Raman microprobe evidence for lignin orientation in the cell walls of native woody tissue. Science. 227, 636-638 (1985).
- Atalla, R. H., Agarwal, U. P. Recording Raman spectra from plant cell walls. J Raman Spectrosc. 17, 229-231 (1986).
- Fukushima, K. Regulation of syringyl to guaiacyl ratio in lignin biosynthesis. J Plant Res. 114, 499-508 (2001).
- Agarwal, U. P. Raman imaging to investigate ultrastructure and composition of plant cell walls: distribution of lignin and cellulose in black spruce wood (Picea mariana). Planta. 224, 1141-1153 (2006).
- Gierlinger, N., Schwanninger, M. Chemical imaging of poplar wood cell walls by confocal Raman microscopy. Plant Physiol. 140, 1246-1254 (2006).
- Gierlinger, N., Schwanninger, M. The potential of Raman microscopy and Raman imaging in plant research. Spectrosc Int J. 21, 69-89 (2007).
- Schmidt, M. Label-free in situ imaging of lignification in the cell wall of low lignin transgenic Populus trichocarpa. Planta. 230, 589-597 (2009).
- Agarwal, U. P. An Overview of Raman Spectroscopy as Applied to Lignocellulosic Materials. Advances in Lignocellulosics Characterization. Argyropoulos, D. S. , TAPPI Press. Atlanta, GA. 201-225 (1999).
- Agarwal, U. P., Ralph, S. A. Determination of ethylenic residues in wood and TMP of spruce by FT-Raman spectroscopy. Holzforschung. 62, 667-675 (2008).
- Schmidt, M. Raman imaging of cell wall polymers in Arabidopsis thaliana. Biochem Biophys Res Comm. 395, 521-523 (2010).
