Summary
Eine Methode der konfokalen Raman Mikroskopie basiert vorgestellt, bietet label-free-Visualisierung von Lignin in pflanzlichen Zellwänden und den Vergleich der Verholzung in verschiedenen Geweben, Mustern oder Arten.
Abstract
Meeting wachsenden Energiebedarf sicher und effizient ist eine dringende globale Herausforderung. Deshalb hat sich die Forschung in die Produktion von Biokraftstoffen, die kosteneffiziente und nachhaltige Lösungen zu finden sucht sich einen aktuellen und kritischen Aufgabe. Lignocellulose-Biomasse ist bereit, die primäre Quelle von Biomasse für die Umstellung auf flüssige Biokraftstoffe 1-6 geworden. Jedoch stellt die Widerspenstigkeit dieser pflanzlichen Zellwand Materialien zu kostengünstigen und effizienten Abbau ein großes Hindernis für ihre Verwendung bei der Herstellung von Biokraftstoffen und Chemikalien 4. Insbesondere wird Lignin, eine komplexe und unregelmäßige poly-Phenylpropanoid Heteropolymer, problematisch, die Ernte Dekonstruktion von Lignocellulose-Biomasse. Zum Beispiel in die Umwandlung von Biomasse für Biokraftstoffe, hemmt es Verzuckerung in Prozesse bei der Herstellung einfacher Zucker für die Gärung 7 ausgerichtet. Die effektive Nutzung pflanzlicher Biomasse für industrielle Zwecke ist in der Tat weitgehend auf das Ausmaß, in dem die pflanzliche Zellwand ist verholzt. Die Entfernung von Lignin ist ein kostspieliges und limitierende Faktor 8 und Lignin ist daher ein wesentlicher Pflanzenzüchtung und Gentechnik Ziel geworden, um Zellwand der Konvertierung zu verbessern.
Analytische Werkzeuge, die die genaue schnelle Charakterisierung der Verholzung der Zellwände von Pflanzen erlauben zunehmend an Bedeutung für die Beurteilung einer großen Anzahl von Populationen. Extractive Verfahren zur Isolierung von nativen Komponenten wie Lignin sind zwangsläufig zerstörerisch, bringt über wesentliche chemische und strukturelle Modifikationen 9-11. Analytische Chemie in-situ-Verfahren sind somit wertvolle Werkzeuge für das kompositorische und strukturelle Charakterisierung von Lignocellulose-Materialien. Raman-Mikroskopie ist eine Technik, die auf unelastisch oder Raman-Streuung von monochromatischem Licht setzt, wie aus einem Laser, wenn die Verschiebung in Energie des Lasers Photonen Molekülschwingungen verbunden ist und stellt eine intrinsische label-free molekularen "Fingerabdruck" der Probe . Raman-Mikroskopie kann nicht-destruktiv und vergleichsweise kostengünstige Messungen mit minimaler Probenvorbereitung leisten, mit Einblicken in chemische Zusammensetzung und die molekulare Struktur in der Nähe von nativen Zustand. Chemical Imaging mittels konfokaler Raman-Mikroskopie wurde bereits für die Visualisierung der räumlichen Verteilung von Cellulose und Lignin im Holz Zellwände 12-14 verwendet. Basierend auf diesen früheren Ergebnissen haben wir kürzlich diese Methode, um Verholzung in Wildtyp-und Lignin-defizienten transgenen Populus trichocarpa (schwarz Pappel) Stammholz 15 Vergleichen angenommen. Die Analyse der Lignin Raman-Banden 16,17 im Spektralbereich zwischen 1.600 und 1.700 cm -1, Lignin Signalintensität und Lokalisation wurden in situ abgebildet. Unser Ansatz visualisiert Unterschiede in Ligningehalt, Lokalisierung und chemische Zusammensetzung. Vor kurzem haben wir gezeigt, Raman Imaging von Zellwandpolymere in Arabidopsis thaliana mit lateraler Auflösung, die Sub-um ist 18 Jahre. Hier ist diese Methode vorgestellt affording Visualisierung von Lignin in pflanzlichen Zellwänden und den Vergleich der Verholzung in verschiedenen Geweben, Mustern oder Arten ohne Färbung oder die Kennzeichnung der Gewebe.
Protocol
1. Probenvorbereitung
- Montieren Sie die Anlage hydratisiert Probe, z. B. Pappel Stammholz oder Arabidopsis thaliana Stamm, in dem Mikrotom.
- Cut Dünnschliffen (typischerweise 20 &mgr; m dick) aus dem nativen Gewebe.
- Übertragen Sie die Teilanlage auf einen Glasobjektträger.
- Weichen Sie das Anlagenteil in D 2 O und mit einem Deckglas, das auf den Objektträger versiegelt wird, um die Verdampfung des D 2 O. verhindern Die Anlage Abschnitt ist nun bereit für die Bildgebung oder es kann für eine spätere Verwendung gespeichert werden.
2. Probenmessung
- Bewerben Immersionsöl zum Mikroskopobjektiv und / oder das Deckglas.
- Ort und sichern die Objektträger auf dem piezoelektrischen Scan des Mikroskops, mit dem Deckglas vor dem Mikroskopobjektiv.
- Sehen Sie sich die Probe durch das Deckglas mit einer hohen numerischen Apertur Eintauchen Mikroskop-Objektiv (100x, NA = 1,40) und suchen Sie die Probe Gebiet von Interesse.
- Nach dem Ausschalten aller anderen Labor-und Mikroskop-Lichtquellen, ortsaufgelöste mikrospektroskopischen Messungen werden durch die Fokussierung bandpassgefilterten monochromatisches grünes Licht (λ = 532 nm) aus einem cw-Laser auf die Probe mit einer typischen Leistungsaufnahme von 10 bis 30 mW durchgeführt ( siehe Abbildung 1 für eine schematische Darstellung der Einrichtung). Autofluoreszenz kann in einigen Proben kommen, die brauchbare Messungen zu verbieten, in welchem Fall der Anregung mit langwelliger Laserlicht kann es ratsam sein.
- Die rückgestreuten Stokes-Raman verschobenen Licht durch das Mikroskop-Objektiv gesammelt, geht durch einen dichroitischen Spiegel, eine Lochkamera, die als räumliche Filter in der konfokalen Aufbau dient, und ein Langpassfilter und wird in den Schlitz eines Gitters konzentriert Spektrometer, wo das Licht spektral zerlegt und detektiert wird durch eine gekühlte CCD-Kamera, so dass ein Raman-Spektrum. Ein Raman-Spektrum von Pappelholz ist in Abbildung 2 gezeigt, mit charakteristischen Lignin Bands im Spektralbereich zwischen 1.600 und 1.700 cm -1.
- Für die chemische Bildgebung und Visualisierung der räumlichen Verteilung Lignin ist ein zweidimensionales spektrale Karte von Rastern der Probe durch den Laserfokus mit dem piezoelektrischen Scan Bühne und die Aufnahme eines Raman-Spektrum für jede Probe Position erworben. Dreidimensionale spektrale Karten kann durch Stapeln zweidimensionale Karten, für die der Laserfokus nacheinander entlang der z-Richtung wurde verstärkt erzeugt werden.
3. Data Analysis
- Für die chemische Bildgebung und Lignin Visualisierung, werden die erhobenen Daten analysiert mit Hilfe von MATLAB (MathWorks, Version 7,7). Die Daten werden in einem dreidimensionalen hyperspectral Würfel, welche der beiden räumlichen Dimensionen und eine dritte Dimension für die spektrale Signale zusammen angeordnet ist.
- Für das Lignin Analyse wird der Spektralbereich von 1550 und 1700 cm -1 berücksichtigt werden (siehe Abbildung 2). Die räumliche Verteilung von Lignin wird visualisiert durch die Integration der Intensität von 1.550 bis 1.700 cm -1 der Baseline-korrigierten Spektren (siehe Abbildung 3). Als Alternative zur Baseline-Korrektur kann der zweiten Ableitung Spektren berechnet und der zweiten Ableitung Gipfel zur Analyse verwendet.
- . Lignin Lokalisierung und Chemie, insbesondere im Hinblick auf coniferaldehyde und Coniferylalkohol-Einheiten können weitere durch die Auswertung der Fläche unter ausgestattet Gauß-Peaks der drei Bänder zwischen 1.600 und 1.700 cm -1 gefunden (siehe Einschub in Abbildung 2 und Refs 15 analysiert werden - 17).
- Intensity Normalisierung zwischen verschiedenen spektralen Karten erfolgt über ein Verweis auf die Peakhöhe des extrinsischen OD-Bande rund 2.500 cm -1 im Durchschnitt Lumen-Spektren, die durch k-means Clustering Klassifizierung erhalten werden. Dies ist entscheidend und ermöglicht es, Lignin Signalintensitäten zwischen verschiedenen Messungen, Gewebe, Proben und Arten zu vergleichen.
4. Repräsentative Ergebnisse
Ein Vertreter Raman-Spektrum von Pappel (Populus angustifolia) Stammholz ist in Abbildung 2 dargestellt. Charakteristisch Lignin Bands sind im Spektralbereich zwischen 1.600 und 1.700 cm -1 gefunden. Als Beispiel ist die räumliche Verteilung von Lignin in einer Pappel Querschnitt in Abbildung 3 dargestellt. Verglichen mit dem sichtbaren Bild, werden morphologisch Zellwand Regionen deutlich unterscheidbar durch verschiedene Lignin Signalintensität. Hohe Lignin Signalintensität in der Zelle Ecken (CC) zu beobachten und, etwas weniger, in der Verbindung Mittellamellen (CML). Niedrigere, aber nicht unerhebliche, Mengen von Lignin sind innerhalb der S2 Wandschicht der Fasern beobachtet. Variabilität von Lignin Signalintensität zu einem gewissen Grad in CC, CML und S2 gefunden, vor allem von Faser zu Faser. Die laterale räumliche Auflösung in unseren Messungen ist ~ 300 nm. Die Qualität der Daten eignet sich gut zur Verholzung zwischen vergleichenBeispiele und weitere sezieren Ligninchemie 15.
Abbildung 1: Eine schematische Darstellung der instrumentalen Setup BP:. Bandpass-Filter, DM: dichroitischen Spiegel, PH: Lochkamera, LP: Langpassfilter.
Abbildung 2: Ein Vertreter Raman-Spektrum von Pappel (Populus angustifolia) Stammholz in D 2 O aufgenommen. Der hervorgehobene Spektralbereich (siehe auch Kasten) markiert den Spektralbereich mit drei Gipfeln zuordenbare Lignin.
Abbildung 3: Raman Lignin Bild (unten) einer Pappel Querschnitt (oben: sichtbares Bild), durch die Integration der Raman-Signal-Intensität von 1.550 bis 1.700 cm -1 erhalten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Lignocellulose-Materialien sind hierarchische und heterogene sowohl im Hinblick auf Struktur und Zusammensetzung. Für eine eingehende Charakterisierung analytische Tools, die chemische Empfindlichkeit, räumliche Auflösung, und das haben, geben Einblick in diese Materialien in der nativen Kontext sind wünschenswert. Das beschriebene Verfahren bietet die Visualisierung von Lignin und Vergleich der Verholzung von Lignocellulose-Biomasse-Anlage mit einer räumlichen Auflösung, die Sub-um-ohne Färbung oder die Kennzeichnung der Proben in einem in der Nähe von nativen Zustand ist. Es erfordert nur minimale Probenvorbereitung und die Messungen sind nicht-destruktiv und vergleichsweise kostengünstig. Die Methode kann nützlich sein bei der Beurteilung Verholzung mit einer großen Anzahl von Populationen assoziiert. Neben Lignin, die Raman-Spektren enthalten auch spektrale Fingerabdrücke von Cellulose und Hemicellulosen, die in einer umfassenden Analyse einbezogen werden können.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Wir danken Andrew Carroll, Bright Chaibang, Purbasha Sarkar (Energy Biosciences Institute, Berkeley), Bahram Parvin (Lawrence Berkeley National Laboratory) und Vincent L. Chiang (North Carolina State University) für eine fruchtbare Zusammenarbeit und hilfreiche Diskussionen. Diese Arbeit wurde von der Energy Biosciences Institute unterstützt. Die Arbeit in der Molecular Foundry wurde durch das Office of Science, Office of Basic Energy Sciences des US Department of Energy unter Vertrag Nr. DE-AC02-05CH1123 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| microscope slides | |||
| cover slips | |||
| D2O | |||
| nail polish | |||
| immersion oil | |||
| tweezers | |||
| pointed brush | |||
| microtome | |||
| confocal Raman microscope |
References
- Herrera, S.
- Himmel, M. E. Biomass recalcitrance: Engineering plants and enzymes for biofuels production. Science. 315, 804-807 (2007).
- Pauly, M., Keegstra, K. Cell-wall carbohydrates and their modification as a resource for biofuels. Plant J. 54, 559-568 (2008).
- Pauly, M., Keegstra, K. Physiology and metabolism 'Tear down this wall. Curr Opin Plant Biol. 11, 233-235 (2008).
- Ragauskas, A. J. The path forward for biofuels and biomaterials. Science. 311, 484-489 (2006).
- Somerville, C.
- Ralph, J., Brunow, G., Boerjan, W. Lignins in Encyclopedia of Life Sciences. , John Wiley & Sons. Chichester. (2007).
- Chiang, V. L.
- Atalla, R. H., Agarwal, U. P. Raman microprobe evidence for lignin orientation in the cell walls of native woody tissue. Science. 227, 636-638 (1985).
- Atalla, R. H., Agarwal, U. P. Recording Raman spectra from plant cell walls. J Raman Spectrosc. 17, 229-231 (1986).
- Fukushima, K. Regulation of syringyl to guaiacyl ratio in lignin biosynthesis. J Plant Res. 114, 499-508 (2001).
- Agarwal, U. P. Raman imaging to investigate ultrastructure and composition of plant cell walls: distribution of lignin and cellulose in black spruce wood (Picea mariana). Planta. 224, 1141-1153 (2006).
- Gierlinger, N., Schwanninger, M. Chemical imaging of poplar wood cell walls by confocal Raman microscopy. Plant Physiol. 140, 1246-1254 (2006).
- Gierlinger, N., Schwanninger, M. The potential of Raman microscopy and Raman imaging in plant research. Spectrosc Int J. 21, 69-89 (2007).
- Schmidt, M. Label-free in situ imaging of lignification in the cell wall of low lignin transgenic Populus trichocarpa. Planta. 230, 589-597 (2009).
- Agarwal, U. P. An Overview of Raman Spectroscopy as Applied to Lignocellulosic Materials. Advances in Lignocellulosics Characterization. Argyropoulos, D. S. , TAPPI Press. Atlanta, GA. 201-225 (1999).
- Agarwal, U. P., Ralph, S. A. Determination of ethylenic residues in wood and TMP of spruce by FT-Raman spectroscopy. Holzforschung. 62, 667-675 (2008).
- Schmidt, M. Raman imaging of cell wall polymers in Arabidopsis thaliana. Biochem Biophys Res Comm. 395, 521-523 (2010).
