ללא תווית באתרו הדמיה של Lignification בתוך קירות התא הצמח

Summary

השיטה מבוססת על מיקרוסקופיה ראמאן confocal מוצג שמקנה ללא תווית להדמיה של ליגנין בדפנות תא הצמח והשוואת lignification ברקמות, מדגמים שונים או מין.

Abstract

פגישה דרישות האנרגיה הגוברת בבטחה וביעילות הוא אתגר עולמי הקשה. לכן, מחקר וייצור דלק ביולוגי, המבקשת למצוא פתרונות חסכונית וברת קיימא הפכה משימה אקטואלי וביקורתי. ביומסה Lignocellulosic צפוי להיות המקור העיקרי של ביומסה לגיור כדי דלקים נוזליים ^1-6. עם זאת, סרבנות של חומרים אלה תא צמח קיר השפלה חסכונית ויעילה מהווה מכשול מרכזי עבור השימוש בהם לייצור דלקים וכימיקלים ^4. בפרט, ליגנין, מורכב סדיר מרובה phenylpropanoid heteropolymer, הופך להיות בעייתי בפירוק postharvest של ביומסה lignocellulosic. לדוגמה בהמרת ביומסה דלק ביולוגי, זה מעכב saccharification תהליכים שמטרתם לייצר סוכרים פשוטים עבור תסיסה ^7. שימוש יעיל של ביומסה הצמח למטרות תעשייה היא למעשה תלויה במידה רבה במידה שבה את דופן התא הצמח lignified. הסרת ליגנין הוא גורם יקר הגבלת ⁸ ו ליגנין ולכן יש להפוך לגידול הצמח מפתח יעד הנדסה גנטית כדי לשפר את ההמרה קיר התא.

כלים אנליטיים המאפשרים אפיון מהיר ומדויק של lignification קירות תא הצמח הופך יותר ויותר חשוב להערכת מספר רב של אוכלוסיות הרבייה. נהלים עקורה עבור בידוד של מרכיבים מקומיים כגון ליגנין הרסניים באופן בלתי נמנע, להביא כימי משמעותי שינויים מבניים ^9-11. שיטות כימיות אנליטיות באתרו ובכך הם כלי רב ערך עבור אפיון ההלחנה מבניים של חומרים lignocellulosic. מיקרוסקופיה ראמאן היא טכניקה מסתמכת על פיזור ראמאן קשיח או של אור מונוכרומטי, כזה מן לייזר, שבו שינוי אנרגיה של פוטונים לייזר קשורה תנודות מולקולריות מציג מהותי ללא תווית "טביעת אצבע" המולקולרי של המדגם . מיקרוסקופיה ראמאן יכול להרשות מדידות בלתי הרסניות וזול יחסית עם הכנה מדגם מינימלי, נותן תובנות לגבי ההרכב הכימי ואת המבנה המולקולרי קרוב למדינה המקורית. דימות באמצעות מיקרוסקופ כימית ראמאן confocal שימש בעבר עבור להדמיה של התפלגות מרחבית של תאית ליגנין בתא קירות עץ ^12-14. בהתבסס על תוצאות אלו קודם לכן, אימצנו לאחרונה בשיטה זו כדי להשוות lignification בסוג בר ליגנין מחסר מהונדס Populus trichocarpa (שחור צפצפה) גזע עץ ^15. ניתוח ראמאן להקות ליגנין ^16,17 באזור ספקטרלי בין 1600 ו - 1700 ^-1 ס"מ, עוצמת האות ליגנין ולוקליזציה מופו באתרם. הגישה שלנו דמיינו הבדלים בתוכן ליגנין, לוקליזציה, ואת ההרכב הכימי. לאחרונה, הראינו הדמיה ראמאן של פולימרים קיר התא thaliana ארבידופסיס עם רזולוציה לרוחב זה משנה ¹⁸ מיקרומטר. הנה, שיטה זו מוצגת והנותן להדמיה של ליגנין בדפנות תא הצמח והשוואת lignification ברקמות, מדגמים שונים או מינים ללא כתמים או תיוג של הרקמות.

Protocol

1. לדוגמא הכנה

1. הר מדגם צמח התייבשות, למשל גזע עץ צפצפה או גזע thaliana ארבידופסיס, ב microtome.
2. חותכים חלקים דקים (בדרך כלל 20 מיקרומטר עבה) מרקמות הילידים.
3. העברת בסעיף צמח לשקופית מיקרוסקופ זכוכית.
4. משרים את סעיף צמח ב D ₂ O ומכסים להחליק זכוכית לכסות, אשר חתום לשקופית מיקרוסקופ כדי למנוע אידוי של D ₂ O. החלק צמח מוכן כעת הדמיה או שזה יכול להיות מאוחסן לשימוש עתידי.

2. לדוגמה מדידה

1. החל שמן טבילה למטרה מיקרוסקופ ו / או להחליק לכסות.
2. המקום ומאובטח השקופית מיקרוסקופ על הבמה סריקה פיזואלקטריים של המיקרוסקופ, עם תלוש את הכיסוי מול המטרה מיקרוסקופ.
3. צפה המדגם דרך להחליק את מכסה באמצעות טבילה גבוהה מספרי הצמצם אובייקטיבי מיקרוסקופ (100x, NA = 1.40) ולאתר את שטח מדגם של עניין.
4. מדידות microspectroscopic לאחר לכבות כל שאר מעבדה מיקרוסקופ מקורות אור, עמדת נפתרה מבוצעים על ידי התמקדות bandpass סינון אור ירוק מונוכרומטי (λ = 532 ננומטר) של CW-לייזר על המדגם עם כוח טיפוסי של mW 10-30 ( ראה איור 1 עבור סכמטי של ההתקנה). Autofluorescence יכול להתרחש כמה דוגמאות, אשר עשוי לאסור מדידות שימושי, שבו עירור המקרה עם אור לייזר באורך גל ארוך יותר עשוי להיות מומלץ.
5. האור האחורי מפוזרים ראמאן סטוקס-מוזז נאסף על ידי המטרה מיקרוסקופ, עובר דרך מראה dichroic, חריר, המשמש כמסנן המרחבית בהגדרת confocal, ומסנן longpass, והוא ממוקד לתוך החריץ של סבכת ספקטרומטר, שם את האור מתפזר spectrally ו זוהה על ידי מצלמת CCD מקורר, נותן ספקטרום ראמאן. ספקטרום ראמאן של עץ צפצפה מוצג באיור 2, עם להקות ליגנין אופייני באזור ספקטרלי בין 1600 ו - 1700 ^-1 ס"מ.
6. עבור דימות כימי ויזואליזציה של התפלגות מרחבית ליגנין, מפה דו מימדי ספקטרלי היא נרכשה על ידי סריקה סריקה המדגם דרך ההתמקדות לייזר עם שלב הסריקה פיזואלקטריים הקלטה ספקטרום ראמאן לכל תפקיד המדגם. תלת ממדי מפות ספקטרלי עשוי להיות שנוצר על ידי הערמה דו מימדי מפות עבורו מוקד לייזר היה צעד ברציפות לאורך בכיוון-z.

3. ניתוח נתונים

1. עבור דימות כימי ויזואליזציה ליגנין, הנתונים שנאספו מנותח באמצעות MATLAB (MathWorks, גרסה 7.7). הנתונים מסודרים קוביה תלת מימדי היפרספקטראלית, המורכבת משני ממדים מרחביים מימד שלישי עבור אותות ספקטרליים.
2. לניתוח ליגנין, באזור ספקטרלי בין 1550 ו - 1700 ^-1 ס"מ נחשב (ראה איור 2). הפריסה המרחבית של ליגנין הוא מדמיין על ידי שילוב העוצמה של 1,550 עד 1,700 ^-1 ס"מ של ספקטרה הבסיס, תיקן (ראה איור 3). כחלופה תיקון הבסיס, נגזרת שנייה ספקטרום עשוי להיות מחושב ואת השנייה נגזרת פסגות משמש לצורך ניתוח.
3. לוקליזציה ליגנין וכימיה, במיוחד בכל הנוגע coniferaldehyde ו moieties coniferyl אלכוהול, יכול להיות מנותח עוד יותר על ידי הערכת השטח מתחת מצויד פסגות גאוס של שלוש להקות נמצא בין 1600 ו - 1700 ^-1 ס"מ (ראה איור 2 הבלעה של השופטים ו 15. - 17).
4. נורמליזציה אינטנסיביות בין מפות שונות ספקטרלית מבוצע באמצעות כהתייחסות את גובה השיא של הלהקה OD חיצוני מתיחות סביב 2,500 ^-1 ס"מ בספקטרום לומן בממוצע, אשר מתקבלים על ידי k-אמצעי סיווג באשכולות. זה קריטי ומאפשר להשוות עוצמות ליגנין אות בין המדידות, רקמות שונות, דגימות ומינים.

4. נציג תוצאות

ספקטרום ראמאן נציג של עץ (Populus angustifolia) גזע צפצפה מוצג באיור 2. להקות ליגנין מאפיין נמצאים באזור ספקטרלי בין 1600 ו - 1700 ^-1 ס"מ. כדוגמה, הפצה המרחבי של ליגנין בתוך חתך עץ צפצפה מוצג באיור 3. לעומת התמונה לעין, להבדיל מורפולוגית קיר התא אזורים הפכו להבחין בבירור בשל עוצמת האות ליגנין שונים. עוצמת אות גבוהה ליגנין הוא ציין בפינות התא (CC) ו, קצת פחות, ב lamellae מתחם באמצע (CML). כמויות נמוכות, אך לא ממשית, של ליגנין נשמרים בתוך שכבת הקיר S2 של הסיבים. השתנות של עוצמת האות ליגנין מצוי במידה מסוימת בתוך CC, CML ו S2, במיוחד סיבים סיבים. ברזולוציה מרחבית לרוחב במדידות שלנו ~ 300 ננומטר. איכות נתונים משאיל את עצמו היטב להשוות בין lignificationדגימות כדי להמשיך לנתח ליגנין כימיה ^15.

איור 1: סכימטי של הגדרת תפקיד BP:. Bandpass מסנן: DM: המראה dichroic, PH: חריר, LP: longpass הסינון.

איור 2: ספקטרום ראמאן נציג של עץ (Populus angustifolia) גזע צפצפה נרשם D ₂ O. אזור ספקטרלי מודגשות (גם לראות את הבלעה) מסמן את האזור רפאים לאחר שלוש פסגות לייחס ספציפית ליגנין.

איור 3: ראמאן תמונה ליגנין (התחתון) של חתך עץ צפצפה (למעלה: תמונת גלוי), שהושג על ידי שילוב של עוצמת האות ראמאן מ 1550 ל 1700 cm ^-1.

Discussion

חומרים Lignocellulosic הם היררכי הטרוגנית מבחינת המבנה והן בהרכב. במשך מעמיק כלים אפיון אנליטי כי יש רגישות כימיים, ברזולוציה מרחבית, וכי לתת תובנות חומרים אלה בהקשר יליד רצויות. השיטה המתוארת מאפשרת ויזואליזציה של ליגנין והשוואה של lignification של ביומסה הצמח lignocellulosic עם רזולוציה מרחבית זה משנה מיקרומטר ללא כתמים או תיוג של דגימות קרוב למדינה המקורית. זה דורש הכנה מדגם מינימלי המדידות הן הרסניות ולא יקר יחסית. השיטה יכולה להיות שימושית בהערכת lignification קשורה למספר רב של אוכלוסיות הרבייה. בנוסף ליגנין, ספקטרום ראמאן מכילים גם טביעות אצבעות ספקטרלית של תאית ואת hemicelluloses, אשר יכול לכלול ניתוח מקיף.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
microscope slides
cover slips
D2O
nail polish
immersion oil
tweezers
pointed brush
microtome
confocal Raman microscope