Summary
Etiket lignin bitki hücre duvarlarında görselleştirme ve farklı dokuları, numune veya türlerin lignification karşılaştırılması sağladığını konfokal Raman mikroskobu dayalı bir yöntem sunulmaktadır.
Abstract
Toplantı artan enerji güvenli bir şekilde taleplerini ve verimli bir şekilde acil bir küresel bir sorundur. Bu nedenle, maliyet-etkin ve sürdürülebilir bir çözüm bulmak istiyor biyoyakıt üretimi araştırma, güncel ve kritik bir görev haline gelmiştir. Lignocellulosic biyokütle biyokütle sıvı biyoyakıt 1-6 dönüşüm için birincil kaynak olmaya adaydır. Ancak, bu bitki hücre duvar malzemelerinin maliyet-etkin ve verimli bir bozulma dinlemezlik, biyoyakıt üretimi ve kimyasallar 4 bunların kullanımı için önemli bir engel sunar . Özellikle lignin, karmaşık ve düzensiz bir poli-phenylpropanoid heteropolymer, hasat sonrası Yapısızlaştırmanın lignocellulosic biyokütle sorunlu olur. Örneğin biyoyakıt biyokütle dönüşüm, basit şekerler fermantasyon 7 üretmeyi amaçlayan süreçlerinde saccharification engeller. Endüstriyel amaçlar için bitki biyokütle etkin kullanımı, bitki hücre duvarı Odunlaşmış olduğu ölçüde büyük ölçüde bağımlı aslında. Ligninin kaldırılması, masraflı ve kısıtlayıcı faktör 8 ve lignin bu nedenle hücre duvarı dönüşüm geliştirmek için önemli bir bitki ıslah ve genetik mühendisliği hedef haline gelmiştir .
Bitki hücre duvarlarının lignification doğru hızlı karakterizasyonu izin analitik araçlar çok sayıda üreme popülasyonlarının değerlendirmek için giderek daha önemli hale gelir. Lignin gibi doğal bileşenlerin izolasyonu için önemli kimyasal ve yapısal değişiklikler 9-11 hakkında Ekstraktif prosedürleri getirerek, kaçınılmaz olarak yıkıcı olan. Yerinde yöntemleri Analitik kimyasal böylece lignocellulosic malzemelerin kompozisyon ve yapısal karakterizasyonu için paha biçilemez bir araç . Raman mikroskobu, bir lazer, lazer fotonların enerji vardiya moleküler titreşimler ile ilgili olduğu gibi, esnek olmayan ya da Raman saçılması monokromatik ışık dayanır ve örnek içsel bir etiket serbest moleküler "parmak izi" sunan bir tekniktir. . Raman mikroskobu yerli durumuna yakın bir kimyasal bileşim ve moleküler yapısı içgörüler vererek, en az numune hazırlama ile tahribatsız ve nispeten ucuz ölçümleri gelemez. Konfokal Raman mikroskobu ile kimyasal görüntüleme, daha önce, selüloz ve ahşap hücre duvarları 12-14 lignin mekansal dağılımının görüntülenmesi için kullanılır olmuştur. Önceki bu sonuçlara dayanarak, son zamanlarda, vahşi tip ve lignin eksikliği olan transgenik Populus trichocarpa (siyah kavak) kök ahşap 15 lignification karşılaştırmak için bu yöntemi kabul ettiler . 1.600 ve 1.700 cm -1, lignin sinyal şiddeti ve lokalizasyonu arasındaki spektral bölgede lignin Raman bantları 16,17 Analiz in situ eşleştirilmiş. Bizim yaklaşımımız, lignin içerik farkları, yerelleştirme ve kimyasal bileşimi görüntülendi. En son, 18 alt-mikron lateral çözünürlüğe sahip Arabidopsis thaliana hücre duvarı polimerlerin Raman görüntüleme gösterdi. Burada, bu yöntem, boyama ya da dokuların etiketleme olmadan bitki hücre duvarlarında lignin görselleştirme ve farklı dokuları, numune veya türlerin lignification karşılaştırılması karşılayabilme sunulmaktadır.
Protocol
1. Numune Hazırlama
- Mikrotom, sulu bitki örnek, örneğin, kavak kök ahşap veya Arabidopsis thaliana kök monte edin .
- Doğal doku ince bölümler (genellikle 20 mikron kalınlığında) kesin.
- Bitki bölüm cam bir mikroskop lamı üzerine aktarın.
- D 2 O bitki bölümünde etmesini sağlayınız ve bir cam kapak kayma, D 2 O buharlaşmasını önlemek için mikroskop lamı üzerine mühürlü ile kapak Bitki bölümü görüntüleme için hazır ya da gelecekte kullanılmak üzere saklanabilir.
2. Numune Ölçümü
- Mikroskop objektif ve / veya kapak kayma daldırma yağ sürün.
- Yerleştirin ve kapağı kayması ile mikroskop objektif bakan, mikroskop piezoelektrik tarama sahnede mikroskop lamı güvenli.
- Yüksek sayısal açıklık immersiyon objektifte kullanarak kapak kayma (100x, NA = 1.40) ile örnek ve ilgi örnek alan bulmak.
- Diğer tüm laboratuvar ve mikroskop ışık kaynakları kapattıktan sonra, pozisyon çözülmesi microspectroscopic ölçümler tipik bir 10 ila 30 mW güç (örnek üzerine bir cw-lazer bant geçiren filtreden monokromatik yeşil ışık (λ = 532 nm) odaklanarak yapılır kurulum şematik bir bkz. Şekil 1). Otofloresans durumunda daha uzun dalga boyunda lazer ışığı ile uyarma tavsiye olabilir, yararlı ölçümleri yasaklamak, bazı örnekler görülebilir.
- Arka dağınık Stokes kaymıştır Raman ışık mikroskop objektif tarafından toplanan, konfokal kurulum mekansal bir filtre olarak hizmet veren bir dikroik ayna, bir iğne deliği, ve longpass filtre geçer ve bir ızgaranın yarık içine odaklanmış spektrometre, ışık Işıksal dağınık ve Raman spektrumu vererek, soğutmalı bir CCD kamera tarafından tespit. Kavak ağacından Raman spektrumu, 1.600 ve 1.700 cm -1 arasında spektral bölgede karakteristik Lignin bantlar, Şekil 2'de gösterilmiştir .
- Mekansal lignin dağılımı kimyasal görüntüleme ve görselleştirme için, iki boyutlu spektral bir harita, raster piezoelektrik tarama aşaması ile lazer odak noktası üzerinden örnek tarama ve Raman spektrumu her bir numune pozisyonu için bir kayıt ile kazanılır. Üç boyutlu spektral haritalar lazer odak z yönünde ardışık adım olduğu için iki boyutlu haritalar istifleme tarafından oluşturulan olabilir.
3. Veri Analizi
- Kimyasal görüntüleme ve lignin görselleştirme için, toplanan veriler MATLAB (MathWorks, sürüm 7.7) kullanılarak analiz edilmektedir. Veri iki mekansal boyutları ve spektral sinyaller için üçüncü bir boyut oluşan üç boyutlu hiperspektral bir küp olarak düzenlenmiştir.
- Lignin analizi için, 1550 ve 1700 cm -1 arasındaki spektral bölgede (bkz. Şekil 2) olarak kabul edilir. Lignin mekansal dağılımı 1.550 ile 1.700 cm bazal düzeltilmiş spektrumları (bkz. Şekil 3) -1 yoğunluğu entegre tarafından görüntülenmiştir. Bazal düzeltme için bir alternatif olarak, ikinci türev spektrumları hesaplanmış ve analiz için kullanılan ikinci türev doruklarına olabilir.
- Coniferaldehyde ve koniferil alkol moieties konusunda özellikle lignin yerelleştirme ve kimya, 1.600 ve 1.700 cm -1 arasında bulunan üç gruplarından monte Gauss doruklarına altında kalan alan (bkz. Şekil 2 ve refs 15 iç değerlendirerek analiz edilebilir 17).
- Farklı spektral haritalar arasında Yoğunluk normalleşme k-means kümeleme sınıflandırılması ile elde edilen ortalama lümen spektrumları, yaklaşık 2,500 cm -1 ekstrensek OD streching yüksekliğine bir referans olarak kullanılarak yapılır. Bu kritik ve bir farklı ölçümler, doku, örnekler ve türler arasında lignin sinyal intensitesi karşılaştırmanızı sağlar.
4. Temsilcisi Sonuçlar
Kavak (Populus angustifolia) kök ahşap bir temsilcisi Raman spektrumu Şekil 2'de gösterilmiştir. Karakteristik lignin bantları, 1.600 ve 1.700 cm -1 arasında spektral bölgede bulunur . Bir örnek olarak, bir kavak ahşap kesit ligninin mekansal dağılımı Şekil 3'te sunulmuştur. Görüntü ile karşılaştırıldığında, morfolojik olarak farklı hücre duvarı bölgelerde, farklı lignin sinyal yoğunluğu nedeniyle açıkça ayırt hale gelir. Yüksek lignin sinyal yoğunluğu biraz daha az bileşik orta lamel (KML), hücre köşeleri (CC) gözlenen ve. Lignin, Aşağı, yine asılsız değil miktarda lifler S2 duvar tabakası içinde görülmektedir. Lignin sinyal şiddeti değişkenlik özellikle fiber fiber içinde bir dereceye kadar, CC, KML ve S2 bulundu. Ölçümlerde lateral mekansal çözünürlükte ~ 300 nm. Veri kalitesi arasındaki lignification karşılaştırmak için kendisini iyi ödünçdaha fazla lignin kimya 15 incelemek örnekleri.
Şekil 1: enstrümantal kurulum şematik BP: bandpass; DM: dikroik ayna, PH: iğne deliği, LP: longpass filtre.
Şekil 2: D 2 O kaydedilen kavak (Populus angustifolia) kök ahşap bir temsilcisi Raman spektrumu. Vurgulanan spektral alanı (da inset görmek) üç doruklarına lignin özellikle atfedilebilir olan spektral bölgede işaretler.
Şekil 3: 1.550 ile 1.700 cm -1 Raman sinyal yoğunluğu entegre ederek elde edilen bir kavak ahşap kesit Raman lignin (alt) (görünür görüntü üst).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Lignocellulosic malzemeleri ve hiyerarşik yapısı ve kompozisyon bakımından heterojen. Kimyasal duyarlılık, uzaysal çözünürlük ve derinlemesine bir karakterizasyonu analitik araçlar için bu malzemelerin yerli bağlamda içgörüler arzu edilir verir. Açıklanan yönteme lignin ve doğal durumuna yakın boyama ya da örneklerin etiketleme alt mikron uzaysal çözünürlüğü ile lignocellulosic bitki biyokütle lignification karşılaştırılması görselleştirme tanıyor. Minimum numune hazırlama gerektirir ve ölçümler tahribatsız ve nispeten ucuz. Yöntemi üreme popülasyonlarının büyük bir sayı ile ilişkili lignification değerlendirilmesinde yararlı olabilir. Lignin ek olarak, Raman, aynı zamanda kapsamlı bir analize dahil edilebilir spektral, selüloz parmak izi ve hemiselüloz, içerir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Andrew Carroll, Parlak Chaibang, Purbasha Sarkar (Enerji Biosciences Enstitüsü, Berkeley), Behram Parvin (Lawrence Berkeley Ulusal Laboratuarı) ve Vincent L. Chiang (North Carolina State University), verimli işbirlikleri ve yararlı tartışmalar için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Enerji Biosciences Enstitüsü tarafından desteklendi. Moleküler Döküm İş Sözleşme No DE-AC02-05CH1123 altında, ABD Enerji Bakanlığı Bilim Ofisi, Temel Enerji Bilimler Ofisi, tarafından desteklenen oldu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| microscope slides | |||
| cover slips | |||
| D2O | |||
| nail polish | |||
| immersion oil | |||
| tweezers | |||
| pointed brush | |||
| microtome | |||
| confocal Raman microscope |
References
- Herrera, S. Bonkers about biofuels. Nat Biotechnol. 24, 755-760 (2006).
- Himmel, M. E. Biomass recalcitrance: Engineering plants and enzymes for biofuels production. Science. 315, 804-807 (2007).
- Pauly, M., Keegstra, K. Cell-wall carbohydrates and their modification as a resource for biofuels. Plant J. 54, 559-568 (2008).
- Pauly, M., Keegstra, K. Physiology and metabolism 'Tear down this wall. Curr Opin Plant Biol. 11, 233-235 (2008).
- Ragauskas, A. J. The path forward for biofuels and biomaterials. Science. 311, 484-489 (2006).
- Somerville, C. Biofuels. Curr Biol. 17, R115-R119 (2007).
- Ralph, J., Brunow, G., Boerjan, W. Lignins in Encyclopedia of Life Sciences. , John Wiley & Sons. Chichester. (2007).
- Chiang, V. L. From rags to riches. Nat Biotechnol. 20, 557-558 (2002).
- Atalla, R. H., Agarwal, U. P. Raman microprobe evidence for lignin orientation in the cell walls of native woody tissue. Science. 227, 636-638 (1985).
- Atalla, R. H., Agarwal, U. P. Recording Raman spectra from plant cell walls. J Raman Spectrosc. 17, 229-231 (1986).
- Fukushima, K. Regulation of syringyl to guaiacyl ratio in lignin biosynthesis. J Plant Res. 114, 499-508 (2001).
- Agarwal, U. P. Raman imaging to investigate ultrastructure and composition of plant cell walls: distribution of lignin and cellulose in black spruce wood (Picea mariana). Planta. 224, 1141-1153 (2006).
- Gierlinger, N., Schwanninger, M. Chemical imaging of poplar wood cell walls by confocal Raman microscopy. Plant Physiol. 140, 1246-1254 (2006).
- Gierlinger, N., Schwanninger, M. The potential of Raman microscopy and Raman imaging in plant research. Spectrosc Int J. 21, 69-89 (2007).
- Schmidt, M. Label-free in situ imaging of lignification in the cell wall of low lignin transgenic Populus trichocarpa. Planta. 230, 589-597 (2009).
- Agarwal, U. P. An Overview of Raman Spectroscopy as Applied to Lignocellulosic Materials. Advances in Lignocellulosics Characterization. Argyropoulos, D. S. , TAPPI Press. Atlanta, GA. 201-225 (1999).
- Agarwal, U. P., Ralph, S. A. Determination of ethylenic residues in wood and TMP of spruce by FT-Raman spectroscopy. Holzforschung. 62, 667-675 (2008).
- Schmidt, M. Raman imaging of cell wall polymers in Arabidopsis thaliana. Biochem Biophys Res Comm. 395, 521-523 (2010).
