Summary
एक confocal रमन माइक्रोस्कोपी पर आधारित विधि से प्रस्तुत किया है कि संयंत्र सेल दीवारों में लेबल मुक्त lignin के दृश्य और lignification के विभिन्न ऊतकों, नमूने या प्रजातियों की तुलना में देता है.
Protocol
1. नमूना तैयार
- हाइड्रेटेड संयंत्र नमूना, जैसे चिनार स्टेम लकड़ी या Arabidopsis thaliana स्टेम सूक्ष्म तक्षणी में, माउंट.
- देशी ऊतकों से कट पतली वर्गों (आमतौर पर 20 सुक्ष्ममापी मोटी).
- एक गिलास खुर्दबीन स्लाइड पर संयंत्र अनुभाग स्थानांतरण.
- डी 2 हे में संयंत्र अनुभाग लेना और एक गिलास कवर पर्ची, जो माइक्रोस्कोप स्लाइड पर सील डी 2 ओ के वाष्पीकरण को रोकने के के साथ कवर संयंत्र अनुभाग अब इमेजिंग के लिए तैयार है या यह भविष्य के उपयोग के लिए भंडारित किया जा सकता है.
2. नमूना मापन
- खुर्दबीन उद्देश्य और / या कवर पर्ची विसर्जन तेल लागू करें.
- प्लेस और खुर्दबीन स्लाइड माइक्रोस्कोप के piezoelectric स्कैन मंच पर खुर्दबीन उद्देश्य का सामना करना पड़ कवर पर्ची के साथ, सुरक्षित.
- कवर एक उच्च संख्यात्मक एपर्चर विसर्जन खुर्दबीन उद्देश्य का उपयोग पर्ची (100x = 1.40 एनए) के माध्यम से नमूना देखें और ब्याज का नमूना क्षेत्र का पता लगाने.
- बंद अन्य सभी प्रयोगशाला और माइक्रोस्कोप प्रकाश स्रोतों स्विचन के बाद, स्थिति हल microspectroscopic माप एक स.ग. लेजर से नमूने पर 10 से 30 मेगावाट की एक विशिष्ट शक्ति के साथ bandpass फ़िल्टर एकरंगा हरी बत्ती (λ = 532 एनएम) ध्यान केंद्रित करके प्रदर्शन कर रहे हैं ( सेटअप के लिए एक योजनाबद्ध चित्र 1 देखें). Autofluorescence कुछ नमूने में पाए जाते हैं, जो उपयोगी माप निषेध कर सकते हैं कर सकते हैं, जो मामले में अब लेजर तरंग दैर्ध्य प्रकाश के साथ उत्तेजना उचित हो सकता है.
- वापस बिखरे हुए स्टोक्स स्थानांतरित रमन प्रकाश माइक्रोस्कोप उद्देश्य के द्वारा एकत्र की है, dichroic दर्पण, एक pinhole, जो confocal सेटअप में एक स्थानिक फिल्टर के रूप में कार्य करता है और एक longpass फिल्टर के माध्यम से गुजरता है, और एक झंझरी के भट्ठा में केंद्रित है स्पेक्ट्रोमीटर, जहां प्रकाश spectrally छितरी हुई है और एक ठंडा सीसीडी कैमरा के द्वारा पाया, रमन स्पेक्ट्रम देने. चिनार की लकड़ी का एक रमन स्पेक्ट्रम चित्रा 2 में दिखाया गया है, 1600 और 1700 सेमी -1 के बीच वर्णक्रमीय क्षेत्र में विशेषता लिग्निन बैंड के साथ .
- रासायनिक और स्थानिक लिग्निन वितरण इमेजिंग के दृश्य के लिए, एक दो आयामी वर्णक्रमीय नक्शा रेखापुंज piezoelectric स्कैन के साथ मंच लेजर ध्यान के माध्यम से नमूना और स्कैनिंग प्रत्येक नमूना स्थिति के लिए रमन स्पेक्ट्रम की रिकॉर्डिंग के द्वारा अर्जित कर ली है. तीन आयामी वर्णक्रमीय नक्शे दो आयामी नक्शे जिसके लिए लेजर ध्यान केंद्रित लगातार z दिशा के साथ कदम रखा था stacking द्वारा उत्पन्न किया जा सकता है.
3. डेटा विश्लेषण
- रासायनिक इमेजिंग और lignin दृश्य के लिए, डेटा एकत्र MATLAB (Mathworks, संस्करण 7.7) का उपयोग करने के लिए विश्लेषण किया है. डेटा एक तीन आयामी hyperspectral घन, जो दो स्थानिक आयामों और वर्णक्रमीय संकेतों के लिए एक तीसरा आयाम से बना है में व्यवस्था की है.
- Lignin विश्लेषण के लिए, 1550 और 1700 सेमी -1 के बीच वर्णक्रमीय क्षेत्र माना जाता है (देखें चित्र 2) . lignin के स्थानिक वितरण 1550 से 1700 आधारभूत सही स्पेक्ट्रा (चित्रा 3 देखें) -1 सेमी तीव्रता एकीकरण द्वारा कल्पना की है. आधारभूत सुधार करने के लिए एक विकल्प के रूप में, दूसरे व्युत्पन्न स्पेक्ट्रा और गणना हो सकता है दूसरी व्युत्पन्न चोटियों के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया.
- Lignin स्थानीयकरण और रसायन शास्त्र coniferaldehyde और coniferyl शराब moieties के संबंध के साथ विशेष रूप से, आगे तीन +१६०० और 1700 सेमी -1 के बीच पाया बैंड के फिट गाऊसी चोटियों के तहत क्षेत्र के मूल्यांकन (चित्रा 2 और 15 refs की इनसेट देख द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है - 17).
- विभिन्न वर्णक्रमीय नक्शे के बीच तीव्रता सामान्य बाह्य आयुध डिपो खींच बैंड के शिखर +२५०० औसत लुमेन स्पेक्ट्रा, जो क्लस्टरिंग वर्गीकरण कश्मीर का मतलब है के द्वारा प्राप्त कर रहे हैं में -1 आसपास सेमी ऊंचाई एक संदर्भ के रूप में प्रयोग किया जाता है. यह महत्वपूर्ण है और एक अलग माप, ऊतकों, नमूनों और प्रजातियों के बीच lignin संकेत तीव्रता की तुलना करने की अनुमति देता है.
4. प्रतिनिधि परिणाम
चिनार (Populus angustifolia) स्टेम लकड़ी का एक प्रतिनिधि रमन स्पेक्ट्रम चित्रा 2 में दिखाया गया है. विशेषता लिग्निन बैंड १,६०० और 1700 सेमी -1 के बीच वर्णक्रमीय क्षेत्र में पाए जाते हैं . एक उदाहरण के रूप में, एक चिनार लकड़ी पार अनुभाग में लिग्निन के स्थानिक वितरण 3 चित्र में प्रस्तुत किया है. दिखाई छवि की तुलना में, आकृति विज्ञान के अलग सेल दीवार क्षेत्रों को स्पष्ट रूप से अलग lignin संकेत तीव्रता के कारण अलग पहचाना हो गया है. उच्च lignin संकेत तीव्रता सेल कोनों (सीसी) में मनाया जाता है और, कुछ हद तक कम यौगिक बीच lamellae (CML) में. Lignin के लोअर, अभी तक असाध्य नहीं, मात्रा में फाइबर की S2 दीवार परत के भीतर मनाया जाता है. Lignin संकेत तीव्रता की परिवर्तनशीलता सीसी CML, और S2 के भीतर कुछ हद तक पाया जाता है, विशेष रूप से फाइबर के लिए फाइबर से. हमारे माप में पार्श्व स्थानिक संकल्प ~ 300 एनएम है. डेटा की गुणवत्ता में ही अच्छी तरह से बख्शी के बीच lignification तुलनानमूनों और करने के लिए आगे लिग्निन रसायन शास्त्र 15 काटना.
चित्रा 1: महत्वपूर्ण भूमिका निभाई सेटअप का एक योजनाबद्ध बी.पी.: bandpass फिल्टर, डीएम: dichroic दर्पण, पीएच: pinhole, एल.पी.: longpass फिल्टर.
चित्रा 2: चिनार (Populus angustifolia) स्टेम डी 2 हे में दर्ज की लकड़ी का एक प्रतिनिधि रमन स्पेक्ट्रम. प्रकाश डाला वर्णक्रमीय क्षेत्र (भी इनसेट देख) वर्णक्रमीय क्षेत्र तीन चोटियों विशेष रूप से लिग्निन करने के लिए attributable होने के निशान.
चित्रा 3: रमन चिनार लकड़ी पार अनुभाग के lignin (नीचे) छवि (ऊपर दिखाई छवि), 1550 के लिए सत्रह सौ -1 सेमी से रमन संकेत तीव्रता समेकित करने के द्वारा प्राप्त है.
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Discussion
Lignocellulosic सामग्री पदानुक्रमित और दोनों संरचना और संरचना के संबंध के साथ विषम हैं. एक में गहराई से लक्षण वर्णन विश्लेषणात्मक उपकरण है कि रासायनिक संवेदनशीलता, स्थानिक संकल्प, और कहा कि के लिए इन सामग्रियों में देशी संदर्भ में अंतर्दृष्टि वांछनीय हैं दे. वर्णित विधि लिग्निन और स्थानिक संकल्प है कि धुंधला हो जाना या देशी राज्य के लिए एक बंद में नमूनों की लेबलिंग के बिना उप सुक्ष्ममापी है साथ lignocellulosic बायोमास संयंत्र के lignification की तुलना के दृश्य परमिट. यह कम से कम नमूना तैयार करने की आवश्यकता है और माप गैर विनाशकारी है और अपेक्षाकृत सस्ती हैं. विधि lignification प्रजनन आबादी की एक बड़ी संख्या के साथ जुड़े का मूल्यांकन करने में उपयोगी हो सकता है. Lignin के अलावा में, रमन स्पेक्ट्रा भी सेलूलोज़ वर्णक्रमीय उंगलियों के निशान और hemicelluloses, जो एक व्यापक विश्लेषण में शामिल किया जा सकता है है होते हैं.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम उपयोगी सहयोग और उपयोगी विचार - विमर्श के लिए एंड्रयू कैरोल, तेज Chaibang, Purbasha सरकार (ऊर्जा बायोसाइंसेज संस्थान, बर्कले), Bahram Parvin (लॉरेंस बर्कले राष्ट्रीय प्रयोगशाला) और विन्सेन्ट एल च्यांग (उत्तरी केरोलिना राज्य विश्वविद्यालय) धन्यवाद. इस काम ऊर्जा बायोसाइंसेज संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था. आण्विक फाउंड्री में कार्य सं डे - AC02 - 05CH1123 अनुबंध के तहत विज्ञान के कार्यालय मूल ऊर्जा विज्ञान के कार्यालय अमेरिकी ऊर्जा विभाग के द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| microscope slides | |||
| cover slips | |||
| D2O | |||
| nail polish | |||
| immersion oil | |||
| tweezers | |||
| pointed brush | |||
| microtome | |||
| confocal Raman microscope |
References
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