Sin etiquetas In situ Imágenes de lignificación de las paredes celulares vegetales

Summary

Un método basado en la microscopía confocal de Raman que se presenta ofrece sin etiquetas de visualización de la lignina en las paredes celulares vegetales y comparación de lignificación en los diferentes tejidos, muestras o especies.

Abstract

Energía satisfacer las crecientes demandas de forma segura y eficiente es un desafío urgente global. Por lo tanto, la investigación sobre la producción de biocombustibles, que busca encontrar soluciones rentables y sostenibles se ha convertido en una tarea de actualidad y crítica. Biomasa lignocelulósica es un punto de convertirse en la principal fuente de biomasa para la conversión a biocombustibles líquidos ^1.6. Sin embargo, la terquedad de estos materiales de la pared celular de los vegetales a la degradación económica y eficiente ofrece un gran impedimento para su uso en la producción de biocombustibles y productos químicos ^4. En particular, la lignina, una compleja e irregular poli-fenilpropanoides heteropolímero, se vuelve problemática a la deconstrucción post-cosecha de biomasa lignocelulósica. Por ejemplo en la conversión de biomasa para biocombustibles, que inhibe la sacarificación en los procesos dirigidos a la producción de azúcares simples para la fermentación de ^7. El uso eficaz de la biomasa vegetal con fines industriales es, de hecho, depende en gran medida del grado en que está lignificada de la pared celular de las plantas. La eliminación de la lignina es un factor de costo y la limitación de ⁸ y la lignina se ha convertido en un mejoramiento de las plantas y el objetivo clave de la ingeniería genética con el fin de mejorar la conversión de la pared celular.

Herramientas analíticas que permitan la caracterización precisa de una rápida lignificación de las paredes celulares de plantas cada vez más importante para la evaluación de un gran número de poblaciones que se reproducen. Procedimientos de extracción para el aislamiento de los componentes nativos como la lignina son inevitablemente destructiva, dando lugar a productos químicos significativos y modificaciones estructurales ^9.11. Química analítica en los métodos in situ son herramientas muy valiosas para la caracterización de la composición y estructura de materiales lignocelulósicos. Microscopía Raman es una técnica que se basa en la dispersión inelástica o Raman de luz monocromática, como la de un láser, que se relaciona con el cambio de energía de los fotones de láser para las vibraciones moleculares y presenta una intrínseca sin etiqueta molecular "huella digital" de la muestra . Microscopía Raman puede permitirse mediciones no destructivas y de bajo costo en comparación con una preparación mínima de la muestra, dando ideas sobre la composición química y la estructura molecular de una cerca de estado nativo. Imagen química por microscopía confocal de Raman ha sido utilizado anteriormente para la visualización de la distribución espacial de la celulosa y lignina en las paredes celulares de madera ^12/14. Basándose en estos resultados antes, han adoptado recientemente este método para comparar la lignificación de tipo salvaje y lignina deficiente transgénicos Populus trichocarpa (negro álamo) madre de madera ^15. El análisis de las bandas Raman lignina ^16,17 en la región espectral entre 1.600 y 1.700 ^cm-1, la intensidad de la señal de la lignina y la localización fueron asignadas en el lugar. Nuestro enfoque visualizar las diferencias en el contenido de lignina, la localización y composición química. Más recientemente, hemos demostrado de imágenes Raman de los polímeros de la pared celular en Arabidopsis thaliana con una resolución lateral que es sub-micras ^18. En este caso, este método se presenta ofreciendo la visualización de la lignina en las paredes celulares vegetales y comparación de lignificación en los diferentes tejidos, muestras o especies sin manchas o el etiquetado de los tejidos.

Protocol

1. Preparación de la muestra

1. Montar la muestra vegetal hidratada, por ejemplo, la madera del tallo o el tronco de álamo de Arabidopsis thaliana, en el microtomo.
2. Los cortes de secciones delgadas (generalmente de 20 m de espesor) a partir del tejido de origen.
3. Transferencia de la sección de la planta sobre un portaobjetos de vidrio.
4. Remoje la sección de la planta en D ₂ O y se cubre con un cubreobjetos de cristal, que se sella en el portaobjetos del microscopio para evitar la evaporación de D ₂ O. La sección de la planta ya está listo para la imagen o se puede almacenar para uso futuro.

2. Ejemplo de medición

1. Aplicar aceite de inmersión para el objetivo del microscopio y / o la hoja de la cubierta.
2. Colocar y fijar el portaobjetos en la etapa de exploración piezoeléctricas del microscopio, con la hoja de la cubierta hacia el objetivo del microscopio.
3. Ver la muestra a través de la hoja de la cubierta con una alta apertura numérica de inmersión objetivo de microscopio (100x, NA = 1,40) y localice el área de la muestra de interés.
4. Después de apagar todas las demás fuentes de laboratorio y microscopio de luz, resueltos posición microspectroscopic mediciones se llevan a cabo centrándose paso de banda, filtrado luz monocromática verde (λ = 532 nm) de un cw-láser en la muestra con una potencia típica de 10 a 30 mW ( véase la Figura 1 para un esquema de la configuración). Autofluorescencia puede ocurrir en algunas muestras, las cuales pueden prohibir medidas útiles, en la que la excitación caso ya la luz del láser de longitud de onda puede ser aconsejable.
5. El back-luz dispersa Stokes-Raman cambiado es recogida por el objetivo del microscopio, pasa a través de un espejo dicroico, un agujero de alfiler, que sirve como un filtro espacial en la configuración confocal, y un filtro de paso largo, y se centra en la ranura de una rejilla espectrómetro, donde se espectralmente la luz dispersada y detectada por una cámara CCD enfriado, dando un espectro Raman. El espectro Raman de madera de álamo se muestra en la Figura 2, con bandas de lignina característica en la región espectral entre 1.600 y 1.700 cm ^-1.
6. Para obtener imágenes de productos químicos y la visualización de la distribución espacial de la lignina, un mapa espectral de dos dimensiones es adquirida por trama de exploración de la muestra a través del foco de láser con la etapa de exploración piezoeléctricos y el registro de un espectro Raman para cada posición de la muestra. Mapas en tres dimensiones espectrales pueden ser generados por apilamiento de mapas bidimensionales que se intensificó el enfoque de láser consecutivamente a lo largo de la dirección z.

3. Análisis de Datos

1. Para la industria química y la visualización de imágenes de lignina, los datos recogidos se analizaron utilizando MATLAB (The Mathworks, la versión 7.7). Los datos se organizan en un cubo hiperespectrales en tres dimensiones, que se compone de las dos dimensiones espaciales y una tercera dimensión para las señales espectrales.
2. Para el análisis de la lignina, la región espectral entre 1550 y 1700 cm ^-1 se considera (ver Figura 2). La distribución espacial de la lignina se visualiza mediante la integración de la intensidad de 1.550 a 1.700 cm ^-1 del espectro de referencia con corrección (ver Figura 3). Como alternativa a la corrección del nivel basal, la segunda derivada de los espectros se pueden calcular y los picos de la segunda derivada para el análisis.
3. Localización de la lignina y la química, especialmente con respecto a coniferaldehyde y fracciones coniferil alcohol, pueden ser analizados mediante la evaluación del área bajo los picos de Gauss equipado de las tres bandas encuentra entre 1.600 y 1.700 ^cm-1 (véase el recuadro de la Figura 2 y 15 Refs. - 17).
4. Normalización de la intensidad entre los diferentes mapas espectrales se realiza tomando como referencia la altura del pico de la banda extrínseca DO se extiende alrededor de 2.500 cm ^-1 en el espectro de luz promedio, que se obtienen por k-means clustering clasificación. Esto es fundamental y permite comparar las intensidades de la lignina de la señal entre las diferentes mediciones, los tejidos, muestras y de especies.

4. Resultados representante

Un espectro Raman representante de madera de álamo madre (Populus angustifolia) se muestra en la Figura 2. Bandas características de lignina se encuentran en la región espectral entre 1.600 y 1.700 cm ^-1. A modo de ejemplo, la distribución espacial de la lignina en la madera de álamo una sección transversal se presenta en la Figura 3. En comparación con la imagen visible, las regiones de células morfológicamente distintos de la pared se distingue claramente debido a la intensidad de la señal diferente de lignina. De alta intensidad de la señal de lignina se observa en las esquinas de células (CC) y, algo menos, en la lámina media compuesta (LMC). Cantidades inferiores, sin embargo, insustancial, no de la lignina se observan en la capa de la pared de las fibras de S2. La variabilidad de la intensidad de la señal de la lignina se encuentra en cierto grado en CC, CML y S2, en especial de la fibra a fibra. La resolución espacial lateral en nuestras mediciones es de ~ 300 nm. La calidad de los datos se presta muy bien para comparar entre lignificaciónmuestras y para diseccionar la lignina química ^15.

Figura 1: Un diagrama esquemático de la configuración del instrumento BP:. Paso de banda de filtro; DM: espejo dicroico, PH: agujero de alfiler; LP: paso largo del filtro.

Figura 2: Un representante de espectro Raman de madera de álamo madre (Populus angustifolia) registrado en D ₂ O. El área resaltada espectral (véase también el recuadro) las marcas de la región espectral que tiene tres picos específicamente atribuibles a la lignina.

Figura 3: imagen Raman lignina (abajo) de una madera de álamo sección transversal (arriba: la imagen visible), que se obtiene mediante la integración de la intensidad de la señal Raman de 1.550 a 1.700 cm ^-1.

Discussion

Materiales lignocelulósicos son jerárquicos y heterogéneos con respecto a la estructura y composición. Para una herramientas de caracterización en profundidad de análisis que tienen sensibilidad a los químicos, la resolución espacial, y que proporcionan información sobre estos materiales en el contexto nativos son deseables. El método descrito permite la visualización de la lignina y la comparación de lignificación de la biomasa vegetal lignocelulósica con una resolución espacial que es sub-micras, sin manchas o etiquetado de las muestras en un primer plano de estado nativo. Se requiere una preparación mínima de la muestra y las mediciones no son destructivas y de bajo costo comparativamente. El método puede ser útil en la evaluación de lignificación asociada con un gran número de poblaciones que se reproducen. Además de la lignina, los espectros Raman también contienen huellas espectrales de celulosa y la hemicelulosa, que pueden ser incluidos en un análisis exhaustivo.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
microscope slides
cover slips
D2O
nail polish
immersion oil
tweezers
pointed brush
microtome
confocal Raman microscope