Summary
함께 Langendorff 모드 절연 심장 재관류,
Abstract
새로 개발 했나 마우스 모델은 심혈관 질환의 분자 변경과 모델 사이의 인과 관계를 결정하는 강력한 연구 도구되고 있습니다. 분자 생물학은 신호 경로의 주요 변화를 식별이 필요하지만, 그것은 기능적 중요성에 대한 대리하지 않습니다. 생리는 손상에 metabolites의 생화 학적 평가와 생리를 결합, 함수의 질문에 대한 답변을 제공할 수 있지만, 마음을 박동하는 심장 기능과 에너 지론의 전체 사진 수 있습니다. 년 동안, 우리 연구실은이 작업을 수행하는 핵 자기 공명 (NMR) 분광법와 함께 격리 심장 perfusions을 활용하고 있습니다. 심장의 에너 지론을 수행하여 측정하는 동안 왼쪽 심실 기능이 Langendorff 모드 절연 심장 perfusions에 의해 평가됩니다
Protocol
- 이러한 실험의 경우, 두 개의 시스템을 동시에 활용하고 있습니다. 31 P 스펙트럼 취득, Bruker 14T 자석의 이동이다 III 콘솔 TopSpin V2.1 소프트웨어가 설치된 컴퓨터 인터페이스입니다. 심장 기능의 평가, 정의 내장된 심장 재관류 시스템은 데이터 분석을위한 LabChartPro 6 소프트웨어를 갖춘 PowerLab 30분의 4 데이터 수집과 인터페이스입니다.
- 0.5mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 5.3mM KCl, 1.2mM MgSO 4, 118mM NaCl, 25mM NaHCO 및 3 : 실험 당일, 크렙스 - Henseleit 버퍼의 1리터은 다음과 같이 준비합니다. 혼합물은 다음 5% CO 2 / 95% 이전 2mM CaCl 2의뿐만 10-15분에 대한 O 2 부풀어 오른 모양이다. 마지막으로, 기판은, 10 MM 포도당과 0.5mM pyruvate의 형태로, 추가되었습니다.
- 실험 도중 온도 조절이 중요합니다. 온수 circulators가 37.0 사이의 온도를 유지하는 데 사용됩니다 - 37.5 ° C 심장이 자석 안에있는 동안. 온도 광섬유 온도 프로브를 사용하여 실험 기간 동안 감시하고 있습니다.
- 재관류 압력과 왼쪽 심실 압력은 데이터 수집 시스템에 연결된 및 포함된 소프트웨어를 사용하여 표시되는 압력 트랜스 듀서를 통해 모니터링됩니다. 이들은 이전 실험 표준 혈압계로 보정됩니다. 또한, 압력 라인은 모든 기포를 제거하기 위해 적절하게 플러시됩니다.
- 150 MM의 인산 나트륨 (KH 버퍼의 이온 강도에 해당되는)의 표준 샘플 전에 심장의 삽입에 프로브를 '교정'하는 데 사용됩니다. 이것은 신호를 촉진하고 심장이 프로브 내에 위치하면 수집 기간을 시작하는 데 필요한 시간을 감소시킵니다.
- 응고를 줄이려면 마우스를 5 분 후에 헤파린 IP 200 유닛, 나트륨 pentobarbital (175 MG / kg) IP가 주어집니다로 주입됩니다.
- 심장이 빠르게 excised (그대로 폐, thymus)와 얼음 차가운 KH 버퍼에 체포됩니다.
- 얼음에 보관하는 동안, 폐 빠르게 제거됩니다. thymus의 엽 (叶)은 식별하고 부드럽게 대동맥을 노출 뒤로 벗겨 수 있습니다. thymus가 제거됩니다. 대동맥은 다음 조심스럽게 모든 주변 조직을 제거하여 격리됩니다.
- 마이크로 suturing의 집게는 부드럽게 루멘을 폭로하는 대동맥의 양쪽 벽을 보유하는 데 사용됩니다. 대동맥은 신중 0.965 mm OD 폴리에틸렌 관 (PE50)에서 만든 정맥에 배치됩니다. 봉합이 빠르게 대동맥 주위에 묶인 상태에서 대동맥은 마이크로 혈관 클램프와 장소에서 개최됩니다. 클립이 제거되고 포셉는 조심스럽게 정맥은 대동맥 뿌리 위에 있는지 확인하는 데 사용됩니다. 추가 관계는 장소에 마음을 가질 필요 추가됩니다.
- 별도의 조직은 집게와 microscissors를 사용하여 제거됩니다. 작은 절개는 왼쪽 외이로 이루어집니다. 부드럽게 마음을 누른 상태에서 0.61 mm OD 폴리에틸렌 관 (PE10)는 신중하게 꼭대기를 통해 좌심방, LV의 캐비티, 밖으로 삽입됩니다. 초과 관이 줄어들 수 있습니다.
- deflated 물이 채워진 풍선은 LV에 아트리움을 통해 삽입하고 접착 테이프 또는 봉합을 사용하는 장소에서 개최됩니다. 연동 펌프 속도는 점차 심장에 충분한 흐름을 제공하기 위해 증가됩니다. 마음 NMR probe에 장소 때까지 심장은 약 2 ML / 분에 상응하는 지속적인 흐름과 함께 perfused 될 것입니다. LV 풍선은 LV 압력 변환기가 작동하는지 확인하기 위해 마이크로 미터 주사기를 사용하여 작은 볼륨 높게됩니다.
- 마음은 신중하게 10mm의 NMR 튜브에 삽입됩니다. 넓은 구멍 "스피너는"튜브 프로브 내의 적절한 위치로 안내하는 데 사용됩니다. 전체 장치는 다음 단단히 접착 테이프와 함께 '탯줄'에 첨부되어 있습니다.
- 심장 / NMR 튜브 10mm NMR 프로브의 코일 내부 때까지 탯줄은 천천히 자석의 위쪽 구멍으로 저하됩니다.
- 마음이 프로브 내의 적절한 위치에되면, 연동 펌프 흐름이 80mmHg의 재관류 압력을 달성하기 위해 조정됩니다. (최대이 시점에 마음이 약 2 ML / 분 일정한 흐름 perfused 것을 기억). 재관류 압력은 다음 펌프 컨트롤러에있는 "대기"메커니즘을 사용하여 유지됩니다. 마음은 그때 15 - 분 평균 기간을 허용합니다. 그 시간 동안, LV 풍선의 크기는 80-10 mmHg의 최종 diastolic 압력을 달성하기 위해 조정됩니다.
- 평균 기간 동안, 그것은 최상 인 신호를 얻기 위해서는 분광계 매개 변수를 최적화하는 것이 필요합니다. 이것은 인 핵이 resonates되는 빈도 ( "조정")에서 라디오 펄스를 설정하고 ( "shimming") 자장이 동질하여 수행됩니다.
- 평균 기간 후, 여러 31 P NMR 스펙트럼을 얻을 수 있습니다. 각 스펙트럼에 대한 수집 기간은 t에 따라 달라집니다그는 필드 자석의 강도, 샘플의 크기, 그리고 구체적인 실험에 필요한 잡음 비율로 신호. 스펙트럼은 2.0 초 60도 플립 각도와 지연 20 μs 256 무선 주파수 펄스에서 얻은 신호를 평균하여 14 Telsa 자석을 사용하여 얻을 수 있습니다. 이 실험은 약 10 분 필요합니다.
대표 결과
데이터 수집 하드웨어 및 LabChart 소프트웨어에서, 심장 기능의 몇 가지 매개 변수는 실험 프로토콜을 통해 측정할 수 있습니다. 심장 기능의 일반적인 측정은, 좌측 심실 개발 압력 (LVDevP)은 수축기 혈압 (그림 1)에서 최종 diastolic 압력 (EDP)를 빼서에 의해 얻어진다. 이 법안은 마우스의 긴장과 심장 (즉, 압력 과부하)의 상태에 따라 달라질 수 있습니다. 그러나, 일반 C57BL6 마우스 심장 LVDevP에서 80-10 mmHg의 고정 최종 diastolic 압력 100-110 mmHg 사이에 일반적으로있다. 또한, LabChart 프로그램은 LV 압력 파의 주기적 측정에 따라 심장 박동수의 측정을 위해 수 있습니다. 다시,이 법안은 다를 수 있지만 마음이 본질적인 요금으로 이길 수있을 때 전형적인 값은 350-400 BPM 있습니다. 그러나 심장은 심장 박동이 420 BPM에 보관됩니다 서성 거려 시스템을 사용하여 표준화하실 수 있습니다. 또한, 수축성 (+ DP / DT)과 휴식 (-dP/dt)의 조치는 LV 압력 파의 첫 번째 파생을 사용하여 추정 수 있습니다. 실험 프로토콜 동안 그것은 압력 볼륨 관계를 통합하여 스탈링 메커니즘을 평가하기 쉽습니다. 이것은 LV 풍선 볼륨의 점진적인 증가를 만들고 LVDevP뿐만 아니라 EDP을 지적하여 수행됩니다. 이러한 값은 다음 그림 2에서 묘사된 꾸몄다 수 있습니다. 스탈링 곡선은 80-10 mmHg의 EDP을 달성하기 위해 필요한 볼륨 LV 챔버 차원의 간접적인 아이디어를 줄 수 지적 최적이지만. 이 컨트롤에 비해 확대 마음은 더 큰 볼륨을 필요로하는 동안 일반적으로 작은 풍선 볼륨이 필요합니다 hypertrophied 마음으로 banding 대동맥의 모델에 사용할 수 있습니다. 표 1은 재관류 프로토콜 동안에 얻은 대표적인 심장 기능 데이터를 표시합니다.
31 P NMR 분광계는 phosphocreatine의 신호 (PCR)과 ATP (γ - ATP, α - ATP 및 β - ATP)뿐만 아니라 그림 2에 표시된 무기 인산염 (PI)에서 세 개의 인산염을 제공할 것입니다. 이 봉우리 각 분석 곡선 아래 영역에 대한 값을 제공합니다. ATP의 양은는 γ - ATP와 β - ATP 영역을 평균하여 추정된다. (NAD 분자가 전체 신호의 알려지지 않은 부분에 기여하기 때문에 α - ATP가 사용되지 않습니다.) 심장의 활기찬 상태는 PCR과 ATP 지역 (ATP 비율 PCR)의 지수에 의해 결정됩니다. 1.7 기본 기판으로 포도당와 함께 제공되는 마우스 중심부에 -이 값은 일반적으로 1.5입니다. 31 P NMR은 ATP 또는 PCR 직접 조치를 제공하지 않습니다 있지만, 봉우리의 면적은 샘플에서 화합물을 포함하는 인의 금액에 비례합니다. 이러한 신호 값은 다른 방법을 사용하여 예상하실 수 있습니다. 예를 들어, 마음 일대에서 고성능 액체 크로마 토그래피 (HPLC)에 의해 ATP의 직접적인 조치는 평균 농도를 얻을 수 있습니다. 이 값은 다음 스펙트럼에서 관찰된 평균 ATP 영역을 교정하는 데 사용할 수 있습니다. PCR 농도는 ATP 영역에 상대적인 PCR 지역에 따라 계산하실 수 있습니다. 그것은 PCR 신호에 무기 인산염의 상대 화학 시프트 (PI) 신호를 분석하여 산도를 측정하는 것도 가능합니다. 다른 라디오 펄스 시퀀스, 크레아틴 키나제 반응 속도 또는 ATP 합성 반응 속도를 사용하여 1도 측정할 수 있습니다. 2
절연 perfused 마음에서 표 1.베이스 심장 기능을 수행합니다. LVDevP : 왼쪽 심실 개발 압력, LVEDP : 왼쪽 심실 최종 diastolic 압력, HR : 심장 박동, RPP : 속도 압력 제품, + DP / DT : 첫 번째 유도체 LV 압력 긍정, -dP/dt : 첫 번째 유도체 LV 압력 부정, PP : 관류 압력, CF : 관상 동맥 흐름.
LabChart Pro 소프트웨어에서 그림 1. 대표 LV 압력 파도.
그림 2. 컨트롤 (실선)과 대동맥 밴드 (점선 라인) 마우스에서 대표 스탈링 곡선. A)로 증가 LV 볼륨 이상 LVDevP으로 표시 수축기 기능은 LV 풍선의 부피에 의해 결정됩니다. B) 증가 LV 볼륨 이상 EDP로 표현으로 Diastolic 기능은 LV 풍선의 부피에 의해 결정됩니다. LVDevP : 왼쪽 심실 개발 압력 (수축기 마이너스 diastolic Pressure); EDP : 최종 diastolic 압력.
절연 perfused 마우스 마음의 그림 3. 대표 31 P NMR 스펙트럼. 비교적 작은 파이 피크를 확인합니다. 포도당 이외에 pyruvate 또는 지방산와 함께 제공된 aerobically perfused 마음에서이 절정을 최소화해야합니다. 국소 빈혈의 기간 동안,이 피크 증가 PCR 피크가 감소하면서. α - ATP 피크의 오른쪽 어깨를 확인할 수 있습니다. 이것은 NAD 분자의 공헌이다. PI : 무기 인산염, PCR : phosphocreatine, ATP : 아데노신 삼인산.
Discussion
Langendorff - perfused 절연 마우스 중심부에 31 P NMR 분광법은 신뢰성과 재현성 데이터를 제공합니다. 3, 4 단, 그것은 LV 풍선의 대동맥과 삽입의 cannulation은 안정적인 심장의 성능을 수 있도록 적절하게 이러한 수행하는 필수적입니다 NMR 안에있는 동안 관. 또한, 온도 조절은 적절한 기본 기능을 달성하기 위해 답해야 해요. 좋은 analyzable NMR 스펙트럼을 얻기에있는 중요한 요인은 노이즈 비율로 신호를 증가하고있다. 이것은 최적의 "조정"을 보장하고 샘플의 "shimming"에 의해 얻을 수 있습니다. 마찬가지로 프로토콜 텍스트에 언급된 사전 심장의 삽입에 대한 표준 샘플의 사용이 용이하게하실 수 있습니다. 적절한 크기의 "샘플"이 또한 도움이 그것이다. 100 개 미만 MG 무게 하트는 일반적으로 낮은 PCR 및 ATP 신호 있으므로 수집 시간이 증가 좋은 인 스펙트럼을 얻기 위해 필요합니다 제공합니다.
심장 기능과 에너 지론에 관한 추가 정보를 저장하기 위해 기존의 프로토콜을 수정하는 방법에는 여러 가지가 있습니다. 저희 연구실에서는, 우리는 다른 지방산의 조합 (낮은 높은 농도에서), 락트 산, ketones, 그리고 인슐린의 존재를 포함할 수 있습니다 혼합 기판 버퍼와 마음을 perfused 있습니다. 재관류 버퍼의 안정 동위 원소의 사용 (즉, 기판 표시 13 C)와 함께, 우리는 TCA 사이클을 표시 아세틸 COA의 상대적 기여에 의해 기판 활용도를 추정하는 능력을 보유하고 있습니다.이 응용 프로그램에 5-7 우리는 isotopomer을 수행 13 C NMR 분광법 13 C3 - 13 C4 - 글루 탐 산염의 분석. 이것은 재관류 프로토콜의 끝에 마음을 동결 - 클램핑 및 냉동 조직의 추출을 수행합니다. 이것은 분석이 별도의 설치 매개 변수와 함께 다른 프로브의 사용을 필요로 추가 실험을 것입니다. 31 P NMR 분광법을 사용하여 심장에 2 deoxyglucose 인산염의 시간 의존 축적을 모니터링하는 동안 다른 응용 프로그램은 버퍼에 deoxyglucose과 포도당의 대체가 포함됩니다. 이 방법은 심근 포도당 이해의 측정을 위해 수 있습니다. 또한 7, 8, 저희 연구실은 국소 빈혈 / reperfusion 높은 워크로드 도전 구성된 재관류 프로토콜의 심장 기능과 에너 지론을 분석했다. 6, 8-10은
요약, 절연 마우스 마음 31 P NMR 분광법은 복잡한 장비의 사용을 필요로하는 기술적으로 도전적인 절차입니다. 그러나, 그것이 산출하는 데이터를 새로 개발 했나 보지 마우스 모델의 기능과 에너 지론을 분석하고자 연구에 귀중한 것입니다. 저희 연구실 들어,이 기술은 심장 기능, 에너 지론 및 대사에 대한 스트레스의 다양한 결과에 대한 우리의 이해에 매우 중요했습니다. 1, 11, 12
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
저자는 실험의 NMR 분광 부분 동안 그녀에 대한 지원 린 스펜서 감사하고 싶습니다. 이 작품은 건강 기금 R01 HL059246 국립 연구소, R01 HL067970, R01 HL088634 (박사 티안로)와 F32 HL096284 (박사 Kolwicz로)의 보조금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Magnesium Sulfate | Reagent | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| EDTA | Reagent | Sigma-Aldrich | E1644 | |
| Potassium chloride | Reagent | Sigma-Aldrich | P4505 | |
| Sodium bicarbonate | Reagent | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Sodium chloride | Reagent | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Calcium chloride dihydrate | Reagent | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| D-Glucose | Reagent | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Sodium Pyruvate | Reagent | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Bruker Ultrashield 600WB Plus | Equipment | Bruker Corporation | ||
| PowerLab 4/30 | Equipment |  ADInstruments |
ML866/P | |
| LabChart 6 Pro | Equipment | ADInstruments |
MLS260/6 | |
| Quad Bridge Amp | Equipment | ADInstruments |
ML224 | |
| STH Pump Controller | Equipment | ADInstruments |
ML175 | |
| Minipuls 3 Peristaltic Pump | Equipment | ADInstruments |
ML172 | |
| Disposable BP Transducer | Equipment | ADInstruments |
MLT0699 | |
| 10mm NMR Sample Tube | Equipment | Wilmad LabGlass | 513-7PP-7 | |
| Polyethylene tubing PE10 | Equipment | BD Biosciences | 427401 | |
| Physiological Pressure Transducer | Equipment | ADInstruments |
MLT844 | |
| Polyethylene tubing PE50 | Equipment | BD Biosciences | 427411 | |
| Micrometer syringe | Equipment | Gilmont Instruments | GS-1101 | |
| McPherson Forceps | Equipment | Miltex Inc. | 18-949 | |
| Castraviejo microscissors | Equipment | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5650 | |
| Neoptix Signal Conditioner | Equipment | Neoptix, Inc. | Reflex - 1 |
References
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